第三节　植物生长调节剂相关检测技术

一、植物生长调节剂检测方法概述

在植物生长调节剂研究应用实践中，随着其应用领域的不断扩展，植物生长调节剂的研发、作物不同生育期植物激素的动态变化、植物生长调节剂的吸收运转、植物生长调节剂在植物和环境中的残留等领域都需要测定相关技术的支撑。

由于植物生长调节剂大多为植物激素的结构类似物，其测定方法是通过参考植物激素和测定方法建立的。植物生长调节剂测定的基本流程包括样品前处理和样品检测等步骤（图4-1）。其中样品前处理即检测样品的制备包括采样、液氮处理、粉碎或匀浆、提取、分离纯化等过程。目前，常用于植物生长调节剂检测的方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、离子色谱法（IC）等。其中，ELISA易受外界条件影响，而HPLC虽然操作相对简单但灵敏度有限。近年来，基于质谱联用的方法由于其高灵敏度和高准确度已成为植物生长调节剂检测的主流方法。目前，更灵敏的串联质谱法（GC-MS/MS或LC-MS/MS）甚至高分辨的多级质谱（MSn）亦开始应用于植物生长调节剂检测实践。

二、检测的样品前处理

在进行植物生长调节剂定量检测前，通常需要经过制样、提取及分离纯化等前处理过程。如果检测对象为固体材料（如植物组织和土壤等），取样后还需要用液氮处理，进行匀浆或粉碎；如果检测对象为液体材料，为了便于后续提取，取样后需要进行浓缩，以缩小样品体积。在进行前处理时应小心操作，并保持低温和遮光条件，尽量减少与氧气接触，以便获得对植物生长调节剂的较高回收率。

（一）植物生长调节剂的分离与纯化

对于植物生长调节剂检测而言，无论是生物样品还是环境样品，其化学组成都十分复杂，因此，从复杂的化学组分中提取出植物生长调节剂是实现定量测定的必要前提。提取过程的基本原理为相似相溶，即植物生长调节剂可以高效溶解于化学性质相似的提取溶剂，从而将其与其他大多数化学物质分开。理想的植物生长调节剂提取方法和提取溶剂需要保证提取的高效率和高回收率。尽管曾有直接用水作为溶剂提取植物生长调节剂的报道，但由于植物生长调节剂本身具有极性，因此通常使用极性有机溶剂进行提取。以往在植物生长调节剂提取时用过的极性有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈、三氯甲烷、丙酮、丙醇、乙酸乙酯和乙酸等。根据不同植物生长调节剂的性质，混合型溶剂（如酸性乙腈-乙酸铵溶液和Bieleski溶液）常被用于抽提样品中的植物生长调节剂，特别在同时检测多种植物生长调节剂时更为常见。此外，超声波辅助提取技术的引入，使植物生长调节剂的提取更加快捷、高效，从而有效减少污染和溶剂使用量，并进一步提高回收率。下列提取流程可用于大多数植物生长调节剂的提取：准确称（量）取一定量的样品，植物组织样品液氮处理后匀浆，其他固体样品直接粉碎，液体样品浓缩干燥；加入预冷的Bieleski抽提缓冲液，涡旋2～5min，4℃直接过夜浸提或超声波辅助浸提30min；4℃，离心5～10min；取上清液至新的离心管，冷冻浓缩至干；根据后续分离纯化的需要用合适的提取溶剂复溶后得到粗提液，即可用于后续的分离纯化。

（二）常用的植物生长调节剂分离纯化方法

利用有机溶剂对样品中植物生长调节剂进行提取后，除去了所有固体杂质和大多数植物生长调节剂以外的化合物，但是由于样品成分过于复杂，许多杂质化合物同样易溶于提取液，须经过进一步的分离纯化后方能进行植物生长调节剂的定量分析。

1．液液萃取

液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，将待测化合物从一种溶剂中转移到另外一种溶剂中。多数情况下，一种液相为水，另一种液相为有机溶剂。液液萃取过程一般由萃取、洗涤和反萃取组成。向待分离溶液（粗提液）中加入与之不相互溶解（至多部分互溶）的萃取剂，形成共存的两个液相。利用原溶剂与萃取剂对各组分的溶解度的差别，使它们不等同地分配在两液相中，然后通过两液相的分离，实现组分间的分离纯化。其中，最简单的液液萃取为单级萃取，即将粗提液与萃取剂充分混匀，让目标组分通过相际界面进入萃取剂中，直到该组分在两相间的分配达到平衡；然后静置沉降并分离成为两层液体，萃取剂转变成的萃取液和样品粗提液转变成萃余液。单级萃取对目标组分所能达到的萃取率较低，往往不能满足后续检测要求，为了提高萃取效率，可采用多级错流萃取、多级逆流萃取、连续逆流萃取、回流萃取和分部萃取等一些改进的方法。液液萃取最早于20世纪70年代开始应用于植物生长调节剂的分离纯化。随着技术的进步，液液微萃取、基于中空纤维的液-液-液微萃取、分散液液微萃取等改进的液液萃取技术在富集能力和萃取效率方面取得了长足进步，这些技术在同时分析多种植物生长调节剂时优势明显。例如，液液微萃取与传统的液液萃取相比，萃取溶剂体积小，有机相中的目标物质的浓缩大，具有低成本和高回收率等优点。

2．固相萃取

固相萃取（SPE）于20世纪70年代后期问世，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于待测物的分离、纯化和浓缩。与传统的液液萃取法相比，可以提高回收率，更有效地将待测物与干扰成分相分离，从而提高检出灵敏度，简化样品前处理过程。固相萃取包括液相和固相的物理萃取过程，固相对待测物的吸附力比溶解待测物的溶剂更大。当样品粗提液通过吸附剂基质时，待测物浓缩在其表面，其他成分则通过流动相排出，从而得到较高纯度的浓缩待测物。根据吸附原理，固相萃取主要包括三类：正相固相萃取、反相固相萃取和离子交换固相萃取。正相固相萃取使用极性吸附剂，目标化合物与吸附剂之间包括氢键、π-π键、偶极-偶极和偶极-诱导偶极等极性-极性相互作用。反相固相萃取使用非极性或弱极性吸附剂，主要依赖于范德华力或色散力等非极性相互作用。离子交换固相萃取则基于目标化合物与吸附剂之间的静电吸引力。

植物生长调节剂的固相萃取操作步骤通常包括：

（1）SPE柱选择　根据待测物或其衍生物的理化性质和样品基质，选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物或其衍生物带电荷，可用离子交换填料；若为中性待测物，可用反相萃取柱。

（2）SPE柱活化　填料干燥时上样会降低待测物保留值，从而降低回收率，所以SPE使用前必须进行湿润活化。甲醇为水溶性有机溶剂，其渗透性很强，既可润湿吸附剂表面，又可渗透到非极性的填料键合相中，使填料更易被水润湿，因此通常先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料，然后再加水或水性缓冲液润洗。

（3）上样　SPE萃取过程应适当控制流速，流速过快不利于待测物与固定相结合，导致回收率降低。

（4）SPE柱清洗　把未与填料结合的杂质洗出。反相SPE的清洗溶剂常用水或水性缓冲液，亦可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐并调节pH值，但加入SPE柱的清洗液应不超过一个SPE柱的容积。

（5）待测物洗脱　一般选用离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。保留能力较弱的SPE填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物。针对可电离待测物，可通过调节pH值促使待测物离子化并用较弱的溶剂洗脱。为了提高回收效率，应尽量采用两次小体积低流速洗脱。

（6）样品干燥　针对植物生长调节剂等痕量物质的检测，为了提高后续仪器检测的灵敏度，一般需要利用真空冷冻干燥法除去洗脱液中的有机溶剂，然后再用优化的流动相复溶待测物。

利用固相萃取方法可以一步实现样品中植物生长调节剂的分离和纯化，能节省时间、减少溶剂消耗、显著提高分离纯化效率和检测灵敏度。目前已有多种商品化的SPE分离柱产品，如Sep-Pak C18、Oasis HLB、Oasis MCX和Oasis MAX等可用于植物生长调节剂的分离纯化。

近年来SPE本身也在不断发展，更多基于不同吸附原理的SPE技术不断涌现。其中，固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技术于1990年由加拿大Waterloo大学Pawliszyn和Arthur首先提出，经过多年的发展，已经可以与HPLC、质谱等高端设备直接偶联，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，增加了分析检测速度并降低了检测成本。为了进一步简化待测物的分离纯化流程，近年来，一种新的磁性固相萃取（magnetic solid-phase extraction，MSPE）技术面世。MSPE技术中，吸附剂为特殊设计的带磁性的固体核心，待测物可以选择性吸附在磁性吸附剂上，通过简单的外加磁场回收磁性吸附剂的方法就可以完成待测物的分离、富集和纯化。如利用Fe3O4@TiO2、Fe3O4/RGO@β-CD等带有磁性的纳米颗粒作为植物生长调节剂的选择性吸附剂，已经成功应用于植物样品中细胞分裂素、生长素、脱落酸、赤霉素等植物生长调节剂的分离纯化，其回收率超过了90%。此外，双层固相微萃取（DL-SPE）以及聚合物整体微萃取（PMME）等新的固相萃取技术兼具高回收率和操作便捷的优点，均可用于植物生长调节剂的分离和纯化。

3．分子印迹

分子印迹（molecular imprinted polymer，MIP）技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子（模板分子、印迹分子）完全匹配的聚合物的制备技术。基于该技术制备的分子印迹聚合物对待测物（模板分子）亲和性和选择性高，在待测物分离纯化应用中具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点。目前，分子印迹技术已在色谱分离、固相萃取、仿生传感、药物分析等领域大量应用，其在植物生长调节剂分离纯化方面的应用潜力巨大。按照单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为分子自组装和分子预组织两种基本方法。分子自组装法（self-assembling）又称非共价法。此方法中模板分子与功能单体之间自组织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体-模板分子复合物，经交联聚合后这种作用被保存下来。常用的非共价键作用包括氢键、静电引力、疏水作用力、电荷转移、金属配位键以及范德华力等，其中氢键应用较多。分子预组织（preorganization）法又称共价法，此法中模板分子首先通过可逆性共价键与功能单体结合形成单体-模板分子复合物，然后交联聚合，聚合后再通过化学途径将共价键断裂而去除印迹分子。目前常用的共价结合作用物质包括硼酸酯、希夫碱、缩醛酮、酯和螯合物等。此外，还可以将二者合二为一，即聚合时单体与印迹分子间作用力为共价键，而在分子识别过程中采用非共价法，从而使该分子印迹聚合物既具有亲和专一性，又具有操作条件温和且易于控制等优点。

目前常用的分子印迹聚合物制备方法如下：

（1）常规方法　即将功能单体在溶液中排列在模板分子周围，经交联干燥之后研磨、破碎、筛分得到一定粒径的分子印迹填料，最后洗脱除去模板分子。该方法操作简单，但后期处理过程复杂、柱效较低。

（2）乳液聚合　将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂中，然后将溶剂移入水中，搅拌，乳化，最后加入引发剂交联、聚合，直接制备粒径较均一的球形分子印迹聚合物材料。

（3）悬浮聚合　采用全氟化碳液体代替传统的有机溶剂-水悬浮介质，在该介质中合成分子印迹聚合物，可消除非共价印迹中存在的不稳定的预组织体。

（4）表面印迹　即在特定粒子表面合成分子印迹聚合物，分子印迹聚合物作为该粒子表面修饰物与之紧密结合。该方法的优点是克服了传统方法获得的MIP会将模板分子包覆在内部的弊端，能够快速、高效洗脱待测物，柱效和回收率较高。

分子印迹技术于20世纪90年代末开始应用于植物生长调节剂的应用，目前已经发展出了常规生长素MIP、磁性生长素MIP等多种技术，利用该方法对样品中的生长素进行分离纯化，回收率达90%以上。

4．免疫纯化技术

免疫纯化技术即利用抗体抗原识别原理发展的分析物分离纯化技术。免疫纯化技术的基本流程包括：首先制备待测物抗体（包括多克隆抗体和单克隆抗体），即以高纯度待测物标准样品为半抗原免疫动物，最终收集血清并纯化获得待测物抗体；其次，抗体的固化，即通过不同相互作用原理将抗体固定在一定的固体介质表面；最后，样品中待测物纯化，即将样品溶液通过附着有抗体的固体界面，通过抗体-抗原结合达到富集和纯化的目的。目前，已有较多利用免疫技术分离纯化植物生长调节剂的成功先例，如将植物生长调节剂抗体固定于特定胶体和色谱柱上发展出免疫亲和胶（immunoaffinity gel，IAG）和免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography，IAC）技术，实现了对脱落酸和细胞分裂素的一步富集和纯化。

5．色谱分离技术

色谱分离技术又称层析分离技术，其利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而达到物质分离纯化目的。按固定相类型和分离原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱等多种类型。目前，最常用的是吸附色谱分离技术。吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂（固定相）时，由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物中各组分分离的方法。常用的极性吸附剂有：硅胶、氧化铝。硅胶呈弱酸性，适于分离酸性和中性化合物；氧化铝呈碱性，适于分离碱性物质。活性炭是常用的非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强吸附能力，从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。为了提高物质分离纯化效率，实现高通量分离纯化的目的，目前，综合了不同吸附剂优点的填料已经实现了商品化，如常用的C8和C18。将C8和C18柱等整合到高效液相色谱中形成的HPLC分离纯化方法已经成为包括植物生长调节剂在内的很多物质分离纯化的基本方法。

此外，随着二维液相色谱（2D-HPLC）的发展，微量样品中植物生长调节剂的分离纯化效率有了更大的提升。二维液相色谱技术利用多通道切换阀将两支色谱柱串联或并联起来，因此可以将在一维色谱系统中未达到满意分离的谱峰进行切割并进入二维色谱柱系统进行再次分离，从而显示出其在分离纯化方面的优势。此外，该系统可以进一步扩展成灵活搭配的多级色谱柱分离系统，富集和分离效果更好，后续定量精度更高。

三、植物生长调节剂的检测方法

对植物生长调节剂进行定量检测的方法有免疫方法、光谱法、电化学方法、生物传感法、色谱法和质谱法等多种，本节主要介绍目前常用的一些检测方法。

1．免疫测定方法

免疫检测方法是应用免疫学理论设计的一系列的测定抗原、抗体等的方法。免疫技术最早于20世纪60年代末开始应用于植物生长调节剂的定量分析。目前在植物生长调节剂测定方面应用较多的技术包括酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和放射免疫（radioimmunoassay，RIA）技术。ELISA和RIA都基于抗体-抗原反应，抗体的特异性直接决定了检测精度，因此使用植物生长调节剂的单克隆抗体通常比多克隆抗体具有更高的检测灵敏度。ELISA是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种高灵敏度的测定技术，包括用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。ELISA方法具有较高的灵敏度，从20世纪80年代开始，ELISA方法逐步成为了植物生长调节剂的经典测定方法之一。目前，尽管ELISA方法的灵敏度无法与质谱方法相提并论，但是商业化的专用试剂盒仍然是植物生长调节剂定量分析的手段之一。RIA技术中，定量标样标记上放射性同位素，其将植物生长调节剂的定量转化为测定放射性，相比于其他免疫分析方法，其精度更高，可达nmol水平。由于RIA需要放射性标样，使用成本相对较高，且需获得公安部门颁发的放射性物质应用许可资格在植物生长调节剂的定量分析方面应用前景有限。

2．高效液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对待测物的分析。HPLC方法已成为化学、生物、医学、工业、农林、商检和法检等学科领域中重要的分析手段之一。高效液相色谱仪主要包含高压输液泵、色谱柱/柱温箱、手动/自动进样器、检测器、馏分收集器等硬件以及数据获取与处理软件。高压输液泵驱动流动相和样品通过色谱柱和检测系统；色谱柱填有粒度5～10μm 的C8、C18等吸附材料。进样器将待测样品引入色谱系统；检测器将目标分析物在柱流出液中浓度的变化转化为光电信号，为HPLC的核心元件，是定量的关键。根据不同检测原理，HPLC检测器分为示差折光化学检测器、紫外吸收检测器、紫外-可见分光光度检测器、二极管阵列紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器等。数据采集及分析平台通过软件把检测器检测到的信号转化成可视数据，并对这些数据进行定量分析。

高效液相色谱早在20世纪70年代就开始应用于植物生长调节剂的检测分析中，目前是分析检测植物生长调节剂的常用方法之一。例如，选用ODS2C18等色谱柱，在多种水果、蔬菜和农作物中建立了氯苯氧乙酸和噻苯隆等多种植物生长调节剂残留的HPLC分析方法，回收率一般都超过了90%，检出下限达 0.02μg/g。

近年来，为了提高HPLC的分析效率，一种在管路和压力等方面实现改进的超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）逐渐进入包括植物生长调节剂在内的微量物质的定量分析领域。超高效液相色谱法具有以下特点：①通过解决小颗粒填料的装填和耐压问题，大大提升了色谱柱性能，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构；②大大提升了溶剂输送系统性能，可以获得并耐受15000psi（1psi＝6894.76Pa）以上高压；③有效地降低了色谱系统的死体积；④完善了快速自动进样和高速检测等功能。

3．质谱法

质谱法（mass spectrometry，MS）可以准确提供所分离组分的分子量和结构信息，能够精确分辨目标待测分子并对其进行定性定量，相比于其他方法，质谱法的灵敏度有了显著提升。质谱工作原理为：离子源将化合物分解成带电离子，其中阳离子进入加速器加速，质量分析器按照质荷比（m/z）的大小顺序进行物质定性和定量分析。目前在有机物分析中应用较多的质谱仪主要包括三重四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪、傅里叶变换质谱仪等。常用的离子源包括电喷雾电离源（ESI）、大气压化学电离源（APCI）、快原子轰击源（FAB）、大气压光电离源（APPI）、基质辅助激光解析电离源（MALDI）等。

为了更加高效地进行植物生长调节剂等有机分子的定性定量分析，在实际应用中通常会结合色谱的定量优势和质谱的定性优势，即实现色谱-质谱联用。色谱-质谱联用技术主要包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、气相色谱-串联质谱技术（GC-MS/MS）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。利用色谱-质谱技术可以实现多种植物生长调节剂的快速定量分析。例如，利用乙腈抽提，氨基固相萃取小柱纯化，Waters Xterra MS C18柱（5μm，150mm×2.1mm）分离，在多反应监测（MRM）负离子模式下建立了水果中氯吡脲残留的液相色谱串联质谱测定方法，检测下限达0.2ng/g，回收率达85%～100%。此外，使用LC-MS 实现了果蔬等农产品中多种植物生长调节剂的同时检测，最小检出下限可达3ng/L。

在植物生长调节剂测定实践中，采用MRM模式可以选择性地监测样品中的特定分析物，可有效地降低噪声，提高检测灵敏度，缩短分析时间。然而，基质效应（由样品基质或共洗脱物质引起的信号衰减或增强）问题对LC-MS的灵敏度和定量可靠性影响较大。以稳定同位素衍生的分析物作内标可以有效地克服基质效应的影响，但商品化的植物生长调节剂稳定同位素内标物的种类非常有限且价格昂贵，不利于普遍应用。近年来，同位素标记衍生技术受到了越来越多的关注，其借助轻/重同位素标记衍生试剂，可获得具有相同官能团的一类分析物的同位素衍生物。以此作为LC-MS定量分析的内标可以降低同位素内标物的造价。目前已有针对于氨基、醛基、羧基等官能团的同位素标记衍生试剂并应用于植物生长调节剂定量分析的报道。例如，以d0/d5-ω-溴乙酰吡啶盐（d0/d5-ω-BPB）、d0/d9-溴代胆碱（d0/d9-BETA）、d0/d3-10-甲基吖啶酮-2-磺酰哌嗪（d0/d3-MASPz）等同位素标记衍生试剂对羧酸类植物生长调节剂进行衍生化，建立了十余种植物生长调节剂的同位素内标定量方法，成功应用于果蔬和环境样品中羧酸类植物生长调节剂的快速、准确测定。

4．生物传感法

植物生长调节剂生物传感器（biosensor）的研发起步较晚，21世纪初才开始进入人们的视野。其主要由植物生长调节剂的识别单元与信号转换检测元件等组成，包括压电型、电化学型、核酸型。生物传感器等在植物激素检测方面取得了较高的灵敏度，尤其是在简化样品前处理、减少实验材料取样量、缩短测定时间和提高可重复性等方面取得了较大的进展。同时，尽管生物传感法在检测灵敏度上还无法与色谱-质谱联用法相媲美，但其具有可以实现活体实时监测植物激素的潜力，值得进一步深入研发。近年来，植物生长调节剂生物传感器研究表现出与分子生物学紧密结合的趋势，用于探索植物体内植物激素活体原位分布。随着电极材料的创新以及信号放大检测技术的进一步发展，随着高特异性、高灵敏度的超微电极的创制，未来生物传感法有望走出实验室，成为植物生长调节剂快速实时测定的新型手段之一。

5．其他测定方法

除上述检测方法外，近年来还对其他测定方法在植物生长调节剂中的应用进行了探索。例如，基于高分辨质谱和聚类分析的代谢组学方法也开始应用于植物生长调节剂测定，用于同时测定植物体内植物激素的游离态、结合态及植物激素衍生物并解析其与其他植物激素间的相互作用。毛细管电泳和化学发光等方法被用于植物生长调节剂测定，但目前已实现的灵敏度一般在μg级，离植物植物生长调节剂检测的实际需求还有一定差距。此外，集成了单细胞毛细管电泳、纳米技术和原子力显微镜等多种先进方法的单细胞分析技术，能对特定细胞中的代谢物进行分析和动态监测；基于质谱的纳电喷雾（nanoelectrospray）活体定位技术可以在植物细胞中定位分析多糖和类黄酮等活性物质。这些新技术的探索为建立植物生长调节剂的测定新方法提供了新的思路。