聚合酶链反应（polymerase chain reaction），简称PCR，是一种常用的分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，为下轮反应作准备；②退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③延伸：DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—退火—延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

16SrRNA集保守性与特异性于一身，是目前应用最广的微生物分子检测的靶基因，已被众多学者用于细菌的快速鉴定，以及慢生长和难以培养细菌的鉴定。

分为三步，每一循环经过变性、退火和延伸，DNA量即增加一倍。

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

引物与DNA模板结合，形成局部双链。

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

最常用的检测PCR扩增产物的方法是凝胶电泳。凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。

该法是一种、简便、快速、常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。溴乙锭（EB）染色后，紫外线下观察电泳条带及其位置，并与核酸分子量标准比较扩增产物的大小。

该法适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子也能分离。

电泳法检测特异性并不高，因此引物二聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

是用一对等量特异性引物，引导扩增DNA模板上的目的片段的技术，该方法是应用最多、范围最广，可用于传染病病原体检测、寄生虫病的早期诊断、肿瘤相关基因检测、遗传病早期诊断、动植物检疫、法医学鉴定以及各类分子生物学研究。

巢式PCR（nested PCR）是指为提高扩增反应的敏感性和特异性，由两对引物分两次扩增同一目的片段的方法。第一对引物称为外引物，其序列为待扩增片段两端的互补序列，扩增出一条较长的产物；第二对引物称为内引物，以此产物为模板扩增出一条较短的目的片段，由于第二次扩增反应的模板是第一次扩增的产物，不但大大提高了反应的灵敏度，而且可根据第二次扩增产物的出现与否判定扩增反应的特异性。

多重PCR（multiplex PCR），又称多重引物PCR或复合PCR，其反应原理、反应试剂、操作过程与一般PCR相同，只是在同一PCR体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个目的片段。多重PCR能在同一PCR管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，比经典PCR效率更高，而且多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大节省时间、试剂及经费开支。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，如在同一患者或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲、乙、丙型肝炎病毒重叠，有时是甲、乙型病毒重叠，有时是乙、丙型肝炎病毒重叠；而肠道致病性细菌的检测，如伤寒、痢疾和霍乱，有时具有相似的肠道症状，单一项目检测容易漏检。多重PCR还可用于某些病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定，如某些病原微生物、遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个位点，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。如乙型肝炎病毒、乳头瘤病毒及单纯疱疹病毒的分型等。为了检测方便，不同病原体或不同亚型的目的产物的长短要有一定的差别，以便产物的电泳分析。

膜结合PCR（membrane－bound PCR）与经典PCR的不同之处在于先将DNA模板经一定处理后固定于硝酸纤维素膜或尼龙，再将固定的DNA用于扩增反应。膜结合PCR特别适用于DNA模板含量极少而其他杂质又太多的样品，可通过漂洗膜纯化DNA模板；也可经过电泳将目的DNA与其他DNA分离，以增加PCR的特异性。

原位PCR是在组织细胞内进行PCR，其基本方法为将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，经一定处理后，在组织细胞片上，加PCR液，覆盖并加液状石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR扩增（有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置）。扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，或者使用荧光素标记的引物，扩增后直接观察，既能分辨鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，如可用于病原体在细胞和组织内的定位监测。该方法结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，对于分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程及病理与转归有重大的实用价值。

将反应系统中由于引物浓度的巨大差别，导致扩增的产物以某条单链DNA为主的PCR称为不对称PCR。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，只是两条引物的浓度比例相差很大（50∶1～100∶1），浓度低的称为限制性引物，浓度高的称为非限制性引物，在最初的十几个循环中，两条DNA的目的片段得到等量扩增，但后来限制性引物被消耗殆尽，只有非限制性引物尚存，扩增的产物主要为该引物引导的单链DNA。不对称PCR主要为序列测定制备单链DNA，其优点是不必在测序之前除去剩余引物。

以RNA为模板的PCR称为反转录PCR（reverse transcriptase PCR，RT－PCR），与前述PCR的不同之处在于首先需在一单引物的介导和反转录酶的催化下，合成RNA的互补链，该互补链称为cDNA，通过加热使反转录酶失活后，加入另一引物，再以该cDNA为模板，在DNA聚合酶催化下合成目的双链DNA片段。反转录PCR的模板可为细胞、病毒的总RNA或细胞mRNA，该方法用于检测RNA病毒或研究真核细胞的基因表达。

标记引物PCR（labeled primers PCR）是利用荧光素、放射性核素或生物素等对PCR引物的5′端进行标记，通过检测荧光素或者放射性核素，直接显示产物的存在；或者利用生物素－亲和素系统与酶促反应结合，借助酶促反应的放大效应，显示目的片段的存在，更加提高PCR的灵敏度。

免疫PCR（IM－PCR）是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来，以检测微量蛋白质的方法。其被检测的目的物不是核酸而是蛋白质，是一种检测病原微生物抗原，尤其是病毒抗原的PCR技术。多利用生物素与亲和素的反应特性，以生物素与亲和素分别标记已知任意DNA和与待测抗原相应的单克隆抗体，生物素与亲和素的结合使两者形成单抗与DNA的嵌合体，再与固相化的待测抗原结合后，用标记引物扩增已知DNA，通过检测扩增产物达到检测抗原的目的。当待测抗原难以直接吸附于固相载体时，可用双抗体夹心IM－PCR检测。其原理是将与被检抗原对应的抗体吸附在载体上，然后使被检抗原与之反应，再用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过亲和素再与生物素化DNA相联结，再以适当的引物对DNA指示分子进行扩增，以扩增产物的有无与多少，反映待测抗原的存在与数量。

基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的、与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。用基因探针技术对人兽共患病病原体进行检测，可得到直接、可靠的结果，并且灵敏度高，有时甚至只要存在一个病原体即可检出。

根据杂交原理，作为探针的核酸序列可以包括整个基因，也可以是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。但探针必须是单链的，并带有容易被检测的标记。

先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞，如大肠埃希菌，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备大量的探针。

首先需分离纯化相应mRNA，以mRNA作模板，在反转录酶作用下，合成与之互补的DNA（即cDNA）。cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。

是人工合成的与已知基因DNA互补的序列，长度可从十几个到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。

为确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号，通常采用放射性核素 ³²P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非放射性核素，如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及放射性核素敏感。非放射性核素标记的优点是保存时间较长，而且避免了放射性核素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerasⅠ）的5′→3′的外切酶活性，切去带有5′磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5′→3′聚酶活性，使 ³²P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3′方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为 ³²P标记的核苷酸所取代。

探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液中加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当其与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3′OH端添加放射性核素标记的单核苷酸，这样也可以获得灵敏度很高的DNA探针。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交可分为2种：

DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交。被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。

根据杂交所用的方法，分为斑点杂交、狭槽杂交和菌落原位杂交等。

有3种固相支持体可用于杂交：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman　541滤纸。常规细菌筛选和各种杂交时多选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。不同商标的尼龙膜需要进行不同处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman　541滤纸有很高的湿强度，最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。

基因芯片系指大量序列已知的寡聚核苷酸探针被固定于支持物（玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜等）上后，与待测标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，获取样品分子的序列信息。该技术最大的优势在于能够同时分析成千上万个基因，其无可比拟的信息量、高通量及快速、准确地分析基因的能力在菌种鉴定、耐药性检测、基因组比较分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂贵和制备芯片成本偏高等因素限制了其临床推广。随着芯片技术在其他生命科学领域的延伸，基因芯片概念已泛化到生物芯片，包括基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片、细胞芯片、流式芯片、组织芯片和芯片实验室等。