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第一节 病原学诊断技术
病原学诊断是通过在实验室对各种标本进行病原学检查，为临床诊断提供病原学依据。病原学检查一般包括标本的采集、直接涂片检查、病原分离培养和鉴定、动物实验等步骤，进行细菌、病毒、其他微生物及寄生虫等的检查。
一、标本采集
（一）标本采集的原则
1.选择合适的标本
根据病原体或宿主的特性及疾病的特点采集不同的标本。需注意有些人兽共患病在发病过程中，标本的种类和采集部位可能不同。
2.早期采集
采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，并尽量在使用抗生素或其他抗菌药物之前采集。
3.无菌采集
采集的标本应避免外源性污染。尽量使用经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌的容器，或采用一次性无菌容器，注意容器不能用消毒剂或酸等化学物品处理。
4.采集适量标本
标本的采集量应足以用于相关检查，不应过少，而且要有代表性。
5.安全采集
采集标本时注意自身和环境安全，防止病原的播散和自身感染。同时也要防止皮肤、黏膜以及环境中正常菌群对标本的污染。
（二）常见标本的采集和处理
1.血液
（1）患者或疑似感染者：
一般采用肘部静脉采血法。成人采血量一般5～10ml，婴幼儿1～3ml。用于病原体培养的血液标本，在采集后立即无菌操作注入装有血液增菌培养基的培养瓶中先进行增菌培养，注意防止污染。用于血清学检查的血液标本，可于常温下放置15分钟等血液完全凝固后分离血清待用。不能马上测定的血清，可置4℃冰箱短期保存，尽量于24小时内完成检测；若不能及时检测，可放－20℃或更低温度的冰箱保存。
（2）动物：
可根据动物的大小选择不同的采血方法，一般较大动物可采用静脉采血，小型动物常用的有割（剪）尾采血、眼眶静脉丛采血、断头采血、心脏采血、耳静脉采血、前肢头静脉采血、后肢小静脉采血等。
血液标本采集后，应尽可能缩短贮存和运输时间，尽快进行各种检验。从采血到进行检验的时间间隔越短，检验结果更加可靠。
2.尿液
（1）患者或疑似感染者：
根据疾病种类和临床表现不同，可通过自然排尿或穿刺法采集尿液，少数需采集24小时尿液。常用的采集方法有：
1）中段尿采集法：
叮嘱患者或疑似感染者用肥皂水清洗外阴和尿道口，再用无菌水或无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦拭后，待自然排出少量尿液后，用无菌容器收集排出的尿液，盖好容器后立即送检。不能立即送检的，置4℃冰箱冷藏，24小时内完成操作。
2）肾盂尿采集法：
对怀疑肾脏被感染的患者，可用导尿管采集肾盂尿。先充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿作为对照，分别收集左右两侧尿液并标记，立即送检。如输尿管收集尿液菌数比对照尿液菌数多或第3次比第1次多，可确定菌尿可能来自肾脏；反之，第1次尿菌数多于第3次尿菌数，则判断感染部位可能为膀胱。
3）膀胱穿刺采集法：
一般用于厌氧菌培养或不能正确留取中段尿而又需确定诊断的儿童。先将耻骨联合上的皮肤进行消毒，然后用无菌注射器作膀胱穿刺，抽取5～10ml膀胱内的尿液，立即送检。该法采集的标本病原体培养阳性，可确定感染。
（2）动物：
根据动物体型大小不同采用不同的方法，常见的有导尿法、输尿管插管、压迫膀胱、膀胱穿刺、剖腹、反射排尿法以及膀胱插管法。
尿液标本采集后，如不能立即送检的，置4℃冰箱冷藏，24小时内完成操作。
3.脑脊液
（1）患者或疑似感染者：
以无菌方法采集脑脊液3～5ml，置无菌试管中送检。脑脊液标本采集后应立即送检或床边接种。一般脑脊液中的病原对温度较敏感，在周围环境温度较低情况下，应35℃保温运送。深部真菌如新型隐球菌等感染的标本应保温并尽快送检，若放置时间过长则会导致无法检出。
（2）动物：
动物脑脊液的采集通常采取脊髓穿刺法。轻轻调节进针方向及角度，如果脑脊液流得太快，插入针芯稍加阻塞，以免导致颅内压突然下降而形成脑疝。
正常人和动物的脑脊液都是无菌的，从脑脊液中检出病原菌是诊断感染的确切依据。
4.粪便
（1）患者或疑似感染者：
可于急性腹泻期及未使用抗菌药物前，采集自然排出的粪便，挑选黏液、脓血部分2～3g或液体1～2ml，置无菌容器中，或置于保存液或增菌培养基中送检。对排便困难、婴幼儿或动物可用肛拭子法采集。
（2）动物：
可用肛拭子法采集。
粪便标本采集后，一般应于1小时内检查完毕，否则可因pH及消化酶等影响导致有形成分破坏分解。不能立即送检的粪便标本应放入Cary－Blair运送培养基中。
5.上呼吸道标本、痰液等标本
（1）患者或疑似感染者
1）上呼吸道标本：
有两种：①鼻咽拭子：将金属棉拭子前端弯曲，高压灭菌后备用。采集时，嘱疑似感染者或患者先用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌根，用生理盐水湿润过的鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口咽部其他组织。②咽拭子：将拭子用无菌生理盐水湿润后，用压舌板轻压舌根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取一支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物，或擦取假膜等病变部位。
2）痰液：
可采取自然咳痰与诱导咳痰法采集。自然咳痰法的最好取晨痰，嘱疑似感染者或患者刷牙后用清水漱口数次，用力咳嗽自气管深部将痰液咳出吐至无菌有螺口的容器中。对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽而取之。对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入含15%氯化钠和10%甘油的水溶液约10分钟，诱导患者出现咳嗽，使痰液容易排出，取得的痰液即为诱导痰。通过这种方式取得的痰标本含有来自肺泡的物质，外观为类似唾液水样，适合培养病原菌。
也可经支气管镜在肺内病灶处直接吸取标本或冲洗后采集支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液等标本。对气管切开的患者，可通过气管插管采集气管内吸出物送检。通过支气管镜用保护性导管支气管刷采取的呼吸道标本，受上呼吸道菌群污染的可能性最小，最适合进行细菌培养。通过保护性导管支气管刷毛收集的标本量大约是0.001～0.01ml，将黏有标本的毛刷放在1ml肉汤中，置旋涡混合器上用力混匀，然后用0.01ml定量接种环取混悬液接种于培养基上。
（2）动物：
动物咳痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。
6.脓液、分泌物、胸腹水及其他
（1）患者及疑似感染者：
封闭性脓肿可在消毒脓肿表面皮肤或黏膜后，直接穿刺抽取脓液后注入无菌试管中；开放性脓肿或瘘管，清洁表面后从深部采取标本；对大面积创伤患者，应采集多个创面分泌物送检；胸、腹水通过胸腔或腹腔穿刺获得，注入无菌试管中送检。标本采集后，应立即送检或床边接种。对标本量极少的可先做增菌培养。
（2）动物：
通过胸腹腔穿刺法收集胸水及腹水，脓肿采用引流或者直接穿刺采集。
7.呕吐物、剩余食物、环境标本
用一次性塑料杯接取患者或患畜的呕吐物、剩余食物，及时送检。也可采集疑似污染的土壤、污水或气溶胶标本送检。
（三）生物安全
在采集标本的过程中，应注意防止病原菌的扩散和感染，并对样本的来源、采集过程和方法等做详细记录。在标本的运送过程中，应采取相应的防护措施。若怀疑强致病性病原进入环境或接触人体，应进行现场消毒，对密切接触者进行医学观察并对染疫或者疑似染疫的动物采取隔离、扑杀等措施。
对未知的病原进行检验应采用较高级别的生物安全设备和保护措施。
二、细菌的检验诊断
1.显微镜直接检査
将标本直接涂布在干净的玻片上后，可直接在显微镜下检查，也可染色后再检查。直接检查不仅可观察细菌的形态特征，还可大致估计细菌的数量。染色检查可判断细菌的类别，也可以通过免疫学方法查相关病原体的抗原进行快速诊断。
显微镜检查是简便而快速的方法之一，但并不适用于所有标本。
（1）脑脊液：
脑脊液中发现细菌是怀疑感染的重要依据。一般可采用革兰染色法进行检查，镜下见革兰阳性或阴性细菌发初步报告。怀疑有分枝杆菌感染的标本，可用抗酸染色后检查。注意脑脊液标本涂片做革兰染色时，有些革兰阳性菌在被白细胞吞噬后，可转变为革兰阴性，需要加以鉴别。抗酸染色可发现抗酸杆菌、寄生虫等病原体。
（2）咽拭子或鼻咽拭子：
口咽和鼻咽部位存在大量正常菌群，革兰染色难以鉴别致病菌。但是对特殊细菌具有提示作用。
（3）痰液、支气管和肺泡灌洗液：
标本涂片、革兰染色，检查并发初步报告，如“见革兰阳性球菌，呈链状排列，形似或疑似××××菌”，痰液标本需注意区分正常菌群和可疑致病菌，支气管和肺泡灌洗液直接镜检发现细菌，具有重要提示意义。
对肉眼观察有黄色颗粒或不透明颗粒的痰液标本，应先用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤后，挑取颗粒做两张涂片，分别行革兰染色和抗酸染色。如发现有革兰阳性，中央为菌丝团，周围呈放射状排列，抗酸染色阳性或弱阳性，提示放线菌或诺卡菌感染；如果菌体大小不一致，或菌体粗大，或有芽胞，结合标本恶臭等情况，提示为厌氧菌感染。
（4）粪便：
一般情况下不做粪便标本的直接检查。怀疑真菌性腹泻、菌群失调或二重感染时，可以涂片或取假膜样粪便，革兰染色后观察菌群分布的大致情况，如发现大量的革兰阳性球菌，或大量粗大杆菌，或大量真菌孢子可确定诊断。怀疑肠结核，可取粪便标本超速离心后，行抗酸染色找抗酸杆菌进行诊断。
（5）尿液：
男性患者的尿液、尿道分泌物或脓液，直接涂片检査，或将尿液离心后取沉淀涂片检査对判断感染具有重要意义。膀胱穿刺尿、肾盂尿等无菌来源部位尿液，离心沉淀后涂片染色检查，阳性结果具有重要提示意义。怀疑结核分枝杆菌感染患者，留取晨尿或24小时尿液，离心浓缩后做抗酸染色检査。中段尿液标本离心沉淀物染色结果，需注意区别正常菌群与可疑致病菌。
（6）脓液及分泌物：
化脓性感染可由单种或多种细菌引起。涂片革兰染色检查可查一般细菌，需注意真菌及放线菌；抗酸染色查找结核分枝杆菌或部分诺卡菌。开放性创口脓液需注意外界细菌和周围正常菌群区别，封闭性脓肿标本的直接染色结果具有重要提示意义。
2.分离和培养
多数细菌可用人工方法培养。根据标本种类、不同检验目的以及直接显微镜检查结果等，选用合适的培养基和培养方法，将标本中的细菌分离、培养，通过鉴定，可作为临床诊断的依据。
（1）常用培养基：
常用的有血平板、巧克力平板和麦康凯、伊红亚甲蓝平板。
1）血平板：
主要用于链球菌、常见细菌及苛养菌的分离、培养及溶血活性的检测。临床标本最好置5%～10%CO 2的培养箱中37℃培养18～24小时。
2）巧克力平板：
主要是用于奈瑟菌属和嗜血杆菌等营养要求较高需氧菌的分离和培养。最好在接种前，37℃培养箱中预温半小时。标本接种后，置5%～10%CO 2的培养箱中培养18～24小时。
3）麦康凯、伊红美蓝（EMB）平板：
主要用于肠道细菌如沙门菌和志贺菌的分离培养。接种后将平板放入恒温培养箱中，37℃培养18～24小时。
（2）细菌培养方法：
细菌的培养方法根据细菌性质和对气体的需求不同，主要有普通培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
1）普通培养法：
又称需氧培养法，可培养需氧菌或兼性厌氧菌。将已接种好的平板、液体培养基等材料，置37℃孵箱在普通大气条件下培养18～24小时即可观察生长情况。但标本中菌量很少或难于生长的细菌（如结核分枝杆菌）需培养3～7天甚至1个月才能生长。
2）二氧化碳培养法：
细菌生长环境需维持气体中二氧化碳浓度为5%～10%。二氧化碳培养法可使用二氧化碳培养箱、烛缸法和化学法。布鲁菌在初次分离时，需5%～10%二氧化碳刺激生长。将已接种好的平板、液体培养基等材料放入后，37℃培养24～48小时即可观察生长情况。少数细菌需延长培养时间至1～2周。
3）厌氧培养法：
用于厌氧菌的分离培养和鉴定。大多数厌氧菌的初代培养生长较慢，故至少应培养48小时。如疑为放线菌则应延长至72～96小时。常用的有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法，前两种方法较简便，不需特殊设备，适用于小型实验室，后一方法设备昂贵，但效果最佳。
（3）各种标本中细菌的分离培养：
根据临床症状和诊断及检验目的，选择合适的培养基和培养方法分离待检标本中的细菌，是病原体分离培养成功与否的关键。
1）血液：
单位体积血液中细菌数量一般较少，直接从血液中分离细菌比较困难。通常需将血液先在增菌培养基中增菌培养后再行分离。
血液接种到培养瓶后，应尽快放入35℃孵育箱培养。每天观察一次，连续观察7天。最好使用自动化血培养仪，可缩短阳性结果报警时间。有阳性报警或人工观察有可疑细菌生长现象，取增菌液做涂片染色镜检并报告细菌的形态和染色性；同时将培养物转种至固体培养基，进行分离培养。培养瓶孵育7天后未见生长，转种后确认无菌生长，报告“血液需氧细菌培养7天未见细菌生长”。
若有细菌生长，根据涂片检査结果，选择接种到不同培养基，如血平板、巧克力平板、SS平板、EMB平板等固体平板，分别放置需氧或厌氧环境、35℃孵育24～48小时。
2）呼吸道分泌物：
一般接种血平板、流感嗜血杆菌选择性平板或麦康凯平板，必要时增加巧克力平板、沙保弱琼脂或念珠菌显色平板。
上呼吸道中有大量正常菌群，因此在观察血平板上细菌的生长情况时，如果为正常菌群细菌，且比例大致正常，应报告“未检出致病菌”；如果某一种菌群明显占多数或接近纯培养，应考虑该菌与疾病有关，鉴定后报告。有时采用半定量计数的方式报告，表示菌群中某种细菌所占的比例，作为诊断时参考。
下呼吸道如气管镜下洗涤液或支气管镜冲洗液细菌培养，排除污染后，一旦检出即为病原菌。
3）粪便：
挑取有代表性的标本，如选择脓血黏液部分，接种于肠道选择培养基SS平板、EMB平板或麦康凯平板上，35℃需氧培养18～24小时后观察结果。对于可疑病原携带者及标本量特别少的，可将标本接种于增菌液35℃孵育18～24小时，再将增菌液转种于肠道强选择性培养基分离培养。
4）尿液：
患者自然排出的尿液，经过尿道口，有大量的正常菌群。为区别污染菌和病原菌，可采用倾注培养法和定量接种法进行尿液菌落计数，以计数结果进行判断。一般以中段尿菌落计数＞10 5cfu／ml为真性细菌尿，＜10 4cfu／ml为正常菌群，10 4～10 5cfu／ml为可疑阳性需复查，如仍为同样结果，则应视为病原菌。尿量、尿液在膀胱中停留的时间及使用利尿剂等会影响尿液菌落计数的结果。对于特殊方法取得的尿液，如肾盂尿或膀胱穿刺尿，排除污染的情况下，只要检出即为病原菌。
尿液一般接种血平板、EMB平板或麦康凯平板，需氧培养18～24小时后观察结果，再根据细菌特性进行鉴定。
5）脑脊液：
脑脊液标本在收到后，应立即接种在35℃预温的血平板或巧克力平板。也可床边接种，直接将脑脊液滴入上述平板中。置5%～10%CO 2环境35℃培养18～24小时，观察细菌生长情况，并根据菌落特征和涂片染色结果进一步鉴定。脑脊液标本一般经3天培养仍未见细菌生长，报告“经3天培养无细菌生长”。
3.细菌的生理生化鉴定
细菌的生理生化特征包括细菌的营养、气体、温度等生长要求，对各种碳水化合物的代谢试验、蛋白质和氨基酸代谢试验、碳源和氮源利用试验，以及各种酶类试验和抑菌试验等。细菌可根据生理生化特征进行鉴定。
（1）碳水化合物代谢试验：
细菌对碳水化合物的代谢特征可用于鉴定，包括氧化－发酵试验、糖类代谢试验以及代谢途径试验。
1）氧化－发酵试验（O－F试验）：
此试验可区分细菌的代谢类型，如肠杆菌科细菌为发酵型，非发酵菌通常为氧化型或产碱型。微球菌属可氧化葡萄糖，而葡萄球菌属则能发酵葡萄糖。
2）糖（醇、苷）类代谢试验：
此类测定细菌对糖类的分解能力和产生的代谢产物。兼性厌氧菌和厌氧菌一般都能发酵糖类。根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。如大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖，沙门菌属则只发酵葡萄糖，不发酵乳糖；即使两种细菌均可发酵同一种糖类，所产生的代谢产物也不尽相同，如大肠埃希菌和志贺菌属均可发酵葡萄糖，但前者产酸、产气，而后者仅产酸。
3）β－半乳糖苷酶试验：
此试验可区分分解乳糖（包括迅速分解和迟缓分解）的细菌与不分解乳糖的细菌。迅速及迟缓分解乳糖的细菌β－半乳糖苷酶试验阳性，如埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等。而不发酵乳糖的细菌如沙门菌属、变形杆菌属等均为阴性。
4）甲基红（MR）试验：
此试验测定细菌对葡萄糖的代谢途径。细菌在代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细菌可进一步将其分解为乳酸、醋酸、甲酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质如醇、酮、醛、气体和水，则培养基的酸碱度维持在pH6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别，前者为阳性，后者阴性。此外，沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，肠杆菌属、克雷伯菌属等为阴性。
5）VP试验：
细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，有些细菌可将丙酮酸进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。培养基中的胍基太少时，加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酸酐等，可加速此反应。本试验常与甲基红试验一起使用。前者为阳性的细菌，后者为阴性，反之亦如此。如大肠埃希菌、沙门菌属、志贺菌属等甲基红呈阳性反应，VP反应则阴性。相反，如沙雷菌属、阴沟肠杆菌等，VP反应阳性，而甲基红反应阴性。
6）七叶苷水解试验：
某些细菌能水解七叶苷生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的亚铁离子起反应，生成黑色的化合物。用于革兰阴性杆菌及肠球菌属的鉴定。克雷伯菌属、肠杆菌属和沙雷菌属能水解七叶苷，肠球菌属和D群链球菌也能水解七叶苷，并耐受胆汁。
7）淀粉水解试验：
产生淀粉酶的细菌可将培养基中的淀粉分解为糖类，滴加碘液在培养基上，在菌落周围出现透明区。
（2）蛋白质和氨基酸代谢试验：
不同细菌分解蛋白质的能力不同，可通过检测加入蛋白质分解代谢后的产物或pH变化鉴定细菌。
1）苯丙氨酸脱氨酶试验：
某些可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨基形成苯丙酮酸和游离的氨，加入三氯化铁试剂可与苯丙酮酸生成绿色的螯合物。若延长反应时间，会引起褪色。本试验特异性较高，变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登斯菌属细菌为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
2）氨基酸脱羧酶试验：
细菌使氨基酸脱羧基生成各种胺和CO 2。不同细菌产生的脱羧酶种类不同，但氨基酸经脱羧后产生的胺可使培养基变碱。最常用的氨基酸为赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶均阳性。
3）精氨酸双水解试验：
精氨酸经两次水解后，生成瓜氨酸和氨，瓜氨酸又在瓜氨酸酶的作用下，生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳，使培养基变碱性。可用于非发酵菌如铜绿假单胞菌的鉴定。
4）尿素分解试验：
某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生的氨使培养基变碱性，酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。主要用于肠杆菌科中的变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登斯菌属的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌、雷极普罗威登斯菌和摩根摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。
5）吲哚试验：
有些细菌能分解色氨酸生成吲哚，吲哚与吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）作用，生成红色的玫瑰吲哚。主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
6）硫化氢试验：
某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子生成黑色硫化物。肠杆菌科中沙门菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属细菌绝大多数阳性，其他菌属阴性。腐败假单胞菌、口腔类杆菌和某些布鲁菌也为阳性。
7）明胶液化试验：
明胶酶是细菌产生的一种胞外酶，能分解明胶为氨基酸，从而失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为液体。沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌等可液化明胶，肠杆菌科其他细菌很少液化明胶。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、腐败假单胞菌也能产生明胶酶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
（3）碳源和氮源利用试验：
某些细菌的唯一碳源和氮源利用试验具有特异性，可用于细菌鉴定。
1）枸橼酸盐利用试验：
有些细菌能利用铵盐为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸钠使培养基变碱性为阳性。肠杆菌科细菌中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均阴性，沙门菌属、克雷伯菌属、黏质和液化沙雷菌及某些变形杆菌以及枸橼酸杆菌阳性；铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。
2）丙二酸盐利用试验：
细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性为阳性。
3）马尿酸盐水解试验：
B群链球菌有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸。苯甲酸与三氯化铁结合生成苯甲酸铁沉淀，而甘氨酸在茚三酮（强氧化剂）作用下，氧化脱氨基生成氨、CO 2和相应的醛，茚三酮被还原为还原型茚三酮。反应过程中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，则形成紫色化合物为阳性。
4）乙酰胺利用试验：
许多非发酵菌产生的脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺释放氨基，使培养基变碱。如果被检菌利用乙酰胺，培养基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培养基颜色不变为阴性。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性，其他非发酵菌大多为阴性。
（4）呼吸酶类试验：
呼吸酶类试验主要包括氧化酶、过氧化氢酶以及硝酸盐还原试验。
1）氧化酶试验：
氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。氧化酶可使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。本试验主要用于弧菌科、奈瑟菌属和假单胞菌属细菌与肠杆菌科细菌进行鉴别。肠杆菌科细菌阴性，弧菌科、非发酵菌阳性（除个别菌种外）、奈瑟菌属阳性。
2）过氧化氢酶试验：
又称触酶试验。过氧化氢酶可使过氧化氢分解为分子态氧。本试验主要用于革兰阳性球菌的初步分群，链球菌属细菌触酶阴性，葡萄球菌及微球菌阳性；金氏杆菌属细菌触酶也为阴性。
3）硝酸盐还原试验：
本试验在细菌鉴定中应用广泛。有些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物；硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸系统中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮。硝酸盐还原过程因细菌不同而异，大肠埃希菌等仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐；假单胞菌等能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物如氮或氧化氮，就称为脱硝化或脱氮化作用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等可产生氮气。
（5）其他酶类试验
1）酯酶试验：
细菌酯酶能分解脂肪生成游离脂肪酸。培养基中加入维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，如果细菌分解脂肪，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色。该试验可用于厌氧菌鉴定。诺维梭菌和产芽胞梭菌阳性，其他梭菌阴性。
2）卵磷脂酶试验：
产气荚膜梭菌产生的卵磷脂酶（即α－毒素），在有钙离子存在时能迅速分解卵磷脂，生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱。产生卵磷脂酶的细菌，培养3小时后在菌落周围形成乳白色混浊环，6小时后可扩大。用于产气荚膜梭菌的鉴定。
3）DNA酶试验：
DNA酶可使脱氧核糖核酸（DNA）长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，水解后的寡核苷酸则可溶于酸。当在DNA琼脂平板上加入盐酸，可在具有DNA酶的菌落周围形成透明环。肠杆菌科细菌中沙雷菌和变形杆菌阳性，革兰阳性球菌中金黄色葡萄球菌可产生DNA酶。
（6）抑菌试验
1）氰化钾试验：
氰化钾可抑制由细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶组成的呼吸酶系统。这些酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾与铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。主要用于鉴别沙门菌属（被抑制）和枸橼酸杆菌属（不抑制）。
2）Optochin敏感试验：
Optochin（乙基氢化脱甲奎宁）干扰肺炎链球菌的叶酸合成，几乎所有的肺炎链球菌都敏感，而其他链球菌均耐药。
3）杆菌肽敏感试验：
A群链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他群链球菌对杆菌肽多耐药。
4）O／129抑菌试验：
O／129即二氨基二异丙基蝶啶，对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌则无抑制作用。
（7）其他试验
1）凝固酶试验：
金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，可使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片法测出；另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶。作用类似凝血酶原物质，可被血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物质，而使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌阴性。
2）链激酶试验：
链激酶是A群链球菌产生的一种激活酶，能激活溶纤维蛋白酶原为有活性的溶纤维蛋白酶，从而溶解纤维蛋白。C和G群链球菌也产生链激酶。用于链球菌的鉴定。
3）CAMP试验：
B群链球菌可产生一种“CAMP”因子，能促进葡萄球菌的β－溶素的溶血活性，在两种细菌的交界处溶血力强，出现箭头型透明溶血区。
4）胆汁溶菌试验：
胆汁或胆盐可使肺炎链球菌溶解，其他链球菌则不能。可用于鉴定肺炎链球菌。
5）石蕊牛乳试验：
将被检菌接种于石蕊牛乳培养基内，由于牛乳内含有丰富的蛋白质和糖类，各种细菌对这些物质的分解能力不同，可有产酸、产气、凝固和胨化等数种不同反应，用以鉴别细菌。
4.血清学反应
细菌通过各种途径感染机体后，机体免疫系统通过免疫应答产生抗体和致敏淋巴细胞以及细胞因子，可用已知的抗体或抗原检测未知抗原或抗体。血清学反应包括对分离细菌进行鉴定，以及用免疫学方法测定患者血清中的抗体（IgG、IgM或总抗体）滴度和非特异性凝集素用于感染辅助诊断。
（1）细菌血清学鉴定：
用已知特异性抗体与分离的未知纯种细菌进行血清学试验，可以确定细菌的种和型，多用玻片凝集法进行鉴定。也可用已知抗体进行免疫荧光、协同凝集、间接血细胞凝集等试验快速检测标本中致病菌的特异性抗原进行鉴定。
1）玻片凝集法：
①操作：用生理盐水将已知抗血清做一定比例（1∶5或1∶10，也有些不需要）稀释；取干净载玻片，在一端滴加一滴抗血清，另一端滴生理盐水做对照；用接种环取待检培养物少许，分别于抗血清及生理盐水中混匀，反复摇动玻片，观察结果。抗血清一端出现明显凝集，生理盐水端浑浊为阳性；两端均浑浊为阴性。②玻片凝集法特点：简单易行，特异性强，可以鉴定菌种及型。③应用：常用于沙门菌、志贺菌、布鲁菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌等的鉴定。
2）胶乳凝集法：
在胶乳颗粒上包被已知型别抗血清，与标本中存在的细菌抗原结合产生凝集鉴定细菌。如肺炎链球菌的快速胶乳凝集试验、链球菌胶乳凝集分型试验等。
（2）血清中抗体测定：
对患者或动物血清中的特异性抗体或相关抗体进行检测以辅助诊断。
1）直接凝集试验：
用已知抗原检测患者血清中抗体，如用伤寒、副伤寒沙门菌菌体和鞭毛抗原检测血清中相应抗体的肥达试验；以及对疑为钩端螺旋体感染患者血清稀释后，将其与标准型别钩端螺旋体菌株进行显微镜凝集试验。
2）胶乳凝集试验：
溶血性链球菌感染后，机体产生抗链球菌溶素O抗体，此抗体与风湿性疾病活动相关，有辅助诊断作用。可用胶乳凝集试验测定，也可用溶血法测定。
（3）非特异性凝集素的测定：
有些病原体感染机体后产生的抗体或凝集素，可与病原体以外的其他抗原产生反应，测定抗体滴度也可辅助诊断。
1）冷凝集试验：
原发性非典型性肺炎患者血清中常出现能与O型红细胞发生凝集的冷凝集素，在0～5℃时产生凝集，37℃凝集消失。
2）嗜异性凝集试验：
用于诊断传染性单核细胞增多症。患者体内会出现对羊红细胞产生凝集的凝集素，该凝集素可被牛红细胞抗原所吸附，不被豚鼠肾细胞抗原吸附。
3）外－斐反应：
为一种非特异性反应，用与立克次体有共同抗原的变形杆菌OX19、OX2、OXk代替立克次体进行凝集反应，辅助诊断试验某些立克次体病。
5.自动化鉴定
细菌的自动化鉴定系统采用数值分类原理，集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。
6.分子生物学鉴定
与传统的表现型方法检测相比，利用分子生物学技术进行基因型鉴定更具特异性。常用的有核酸扩增技术、核酸杂交和生物芯片技术。
（1）细菌种属的鉴定：
可用DNA的G＋C%含量测定，全细胞DNA－DNA杂交和16SrRNA同源性分析技术。其中16SrRNA分子具有高度保守性，适用于细菌的分类和鉴定。
（2）细菌种属特异基因：
通过检测某些细菌种特有或属共有基因，可以鉴定细菌的种或属。如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌；IS6110、IS986插入片段为结核分枝杆菌复合群所共有。
三、真菌的检验诊断
真菌形态学检查是浅部真菌感染病原学检测的主要内容，镜下观察菌丝形态、孢子和子实体是鉴别真菌的重要依据，肉眼观察菌丝体在生长中组成不同性状的菌落也有助于鉴别真菌。除少数特殊菌种外，浅部标本的真菌检查结果阳性仅提示真菌存在，阴性结果也不能排除真菌感染。而深部真菌标本检出真菌，可确定诊断。
1.标本采集
无论怀疑浅部还是深部真菌感染，所有标本采集尽量采用无菌操作，避免正常菌群污染。
（1）皮肤、指甲和毛发：
用75%乙醇消毒病灶部位后，用无菌手术刀片在病灶边缘或囊泡处，刮取皮层或角质层。感染的指甲可以切断，较深部位可用刀片刮取。有些真菌感染毛发后在紫外灯下会产生荧光，可在紫外灯照射下用镊子拔取病发。也可用透明胶带黏取皮肤表面细胞。
（2）血液：
抽取静脉血注入血液细菌增菌瓶中。
（3）脑脊液、胸腹水、脓液、肺泡支气管冲洗液：
同细菌培养标本采集。
（4）口咽、泌尿生殖道标本：
注意避开正常菌群的污染。
2.直接检查
根据标本是否经染色处理，分为不染色标本和染色标本的直接检查法。
（1）不染色标本：
将标本置玻片上，加盖玻片并压紧，在较暗的光线下，显微镜下寻找菌丝和孢子。检出菌丝和孢子，即确定真菌感染。
根据标本的性质和种类不同，选用不同的标本处理液：①氢氧化钾适用角质层较厚、致密、难于透明的标本，如指甲、毛发、皮肤鳞屑等；②生理盐水多用于观察真菌的出芽现象；③墨汁主要用于检查新生隐球菌；④水合氯醛－苯酚－乳酸封固液透明力强，结晶少，易保存。
（2）染色标本：
有些真菌如深部真菌，染色后可更清楚地观察。常用革兰染色法（所有真菌均为革兰阳性，适用于白念珠菌、孢子丝菌和组织胞浆菌）、伊红－亚甲蓝（Wright）或伊红－天青（Giemsa）染色法（适用于组织胞浆菌），乳酸苯酚棉兰染色法（真菌染成蓝色，适用于所有真菌）、糖原染色法（真菌胞壁多糖物质被氧化而释放出醛基，与Schiff试剂中的亚硫酸复红及焦亚硫酸钠作用而显示红色，可用于标本直接涂片的染色、组织切片的染色，也可对已进行苏木紫伊红染色的组织切片重染。真菌呈红色，背景淡绿色，细胞核蓝色。糖原、透明质酸、黏蛋白、透明蛋白、血纤维蛋白及胶质颗粒等都呈红色）、嗜银染色法（GMS法）、黏蛋白－卡红（MCS）法（新生隐球菌的鉴别，隐球菌细胞壁和荚膜染成红色，细胞核黑色，背景黄色。孢子丝菌和鼻孢子菌的胞壁也被染成红色）、荧光染色等。
（3）分离培养：
从标本中分离真菌获得纯培养物，有利于进一步进行鉴定。除了少数真菌外，均可在人工培养基上生长。临床深部和浅部真菌一般以沙氏（sabouraud）培养基为基准，描写菌落的形态。常用无选择性培养基、选择性培养基、鉴别培养基进行培养。
1）试管培养法：
在大口径试管中装入培养基，制成斜面。将临床标本接种其中。使用方便、不易污染。
2）大培养法：
在培养皿或大型培养瓶中装入培养基，接种各种标本。培养后菌落较大，便于观察。但该法容易污染，不适合球孢子菌、组织胞浆菌等传染性强的真菌培养。
3）小培养法：
又称微量培养法，是观察真菌结构及生长发育的有效方法。①玻片法：在灭菌玻片上滴加少许培养基，待凝固后接种标本，然后加灭菌的盖玻片，放入适合的培养皿中培养。肉眼观察到有菌生长，即可取出在显微镜下观察。②琼脂方块培养法：在无菌平皿中，放入无菌的U型或V型玻璃棒（或其他支持物），取1片无菌载玻片置于其上，从平板培养基上取4～5mm厚、8mm×8mm大小的琼脂块置于载玻片上。在琼脂块四周接种标本，然后加盖无菌盖玻片进行培养。肉眼发现有菌生长，提起盖玻片并将其放在载玻片上，于显微镜下观察。③小型盖片直接培养法：将标本接种在试管或平板中，取一张11mm×11mm大小的无菌盖玻片，薄薄地加1层培养基。将此盖玻片有培养基的面朝向接种处插入琼脂，在适当环境培养后，肉眼可见有菌生长时取出盖玻片，有菌面朝下直接覆盖在加有封固液的载玻片上，显微镜下观察。
（4）培养结果观察：
培养后主要观察真菌的菌落，包括以下内容：
1）生长速度：
在7～10天内出现菌落者，为快速生长；3周只有少许生长为慢速生长。菌落生长的快慢与菌种、培养条件有关。
2）菌落大小：
以毫米（mm）为单位记录菌落直径。菌落大小与菌种、生长速度、培养时间有关。
3）表面形态：
菌落表面可为平滑、凸起或凹陷、皱褶等，有的菌落表面可出现沟纹，如脑回状、放射状或同心圆状。
4）菌落性质：
有酵母型、酵母样型和丝状菌落。酵母型菌落外观光滑、质地柔软，呈乳酪样，与细菌菌落相似，如隐球菌。酵母样型菌落与酵母型菌落相似，但形成假菌丝，伸入培养基中，如念珠菌。丝状菌落是多细胞真菌的菌落形态，呈棉絮状、绒毛状或粉末状，依菌种不同而异，菌落形态多变，是鉴定的重要依据。
5）菌落颜色：
菌落随菌种不同表现出不同的颜色。丝状菌落的表面和底层颜色不同。
6）菌落边缘：
有些菌种整齐如刀切，有些呈羽毛状，随菌种不同而异。
7）菌落底部：
有些菌落会陷入琼脂中，有时甚至使培养基开裂。
（5）鉴定：
真菌的鉴定主要依赖菌落特征和形态、结构的差异，同时需借鉴其生长特性。酵母菌鉴定以形态为主，辅以少量的生化反应。
1）形态学检测及代谢试验：
形态学检测是最经典的真菌鉴定方法。另外，测定真菌的特异生化反应可用于鉴定，如糖发酵和糖同化试验用于念珠菌属内鉴定，新生隐球菌分解尿素试验等。
2）动物试验：
动物接种即可有效分离病原性真菌，也可确定真菌的致病性。常用小白鼠接种新生隐球菌、孢子丝菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌。巴西芽生菌、球孢子菌应接种豚鼠睾丸内。家兔对白念珠菌、皮肤丝状菌比较敏感。
3）病理组织检查：
病理组织检查是诊断深部真菌病的重要方法。真菌引起的病理变化是非特异的，若用特殊染色后在组织内发现真菌孢子或菌丝，具有诊断意义。
4）免疫学检查：
与其他微生物相比，真菌产生的抗体慢而滴度低，变态反应严重。在怀疑真菌感染，但不能获得病原学证据时，如急性组织胞浆菌病、曲霉型支气管炎等，需依靠免疫学手段进行辅助诊断。
5）核酸检测：
应用分子生物学技术，如DNA探针杂交、PCR技术检测组织标本中的真菌DNA进行诊断，正在不断研究和试验中。目前序列分析最常选用的目的片段是rDNA复合体，由于18SrDNA和28SrDNA序列相对保守，多用于设计真菌通用引物，而ITS1和ITS2则多用于设计种特异性引物。目前应用于临床检测的目的片段有18SrRNA、ITS、P450、5SrRNA、gp43和26SITS等。
6）特殊抗原测定：
检测血液标本中真菌细胞壁成分，如曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）抗原和（1，3）－β－D葡聚糖［（1，3）－β－D－glucan，BG］，是诊断侵袭性真菌感染的微生物学检查依据之一。新生隐球菌的荚膜多糖抗原可用乳胶凝集试验测定，组织胞浆菌的热稳定多糖荚膜抗原可在血清、尿液、支气管肺泡灌洗液中检出。
7）代谢产物检测：
与真菌感染有关的代谢产物主要是D－阿拉伯醇（D－arabinitol）和D－甘露醇（D－mannitol），快速测定这些产物具有诊断价值。在抗真菌治疗时，测定宿主体内这些产物量的变化可以反映治疗效果。
8）念珠菌显色培养基：
念珠菌属真菌在显色培养基上生长后，不同菌种产生的胞外酶（如脯氨酸氨肽酶、β－半乳糖苷酶等）水解培养基中的色原性底物，形成不同的菌落颜色和形态。在培养24～48小时后提供结果。有多种商品化培养基可用。
四、病毒的检验诊断
病毒性疾病在临床上非常多见，越来越引起人们的重视。由于病毒培养和检测技术对各方面的要求较高，临床实验室目前多开展对病毒的免疫学方面检测，很少进行病原学方面的检查。
随着对病毒性疾病的重视以及仪器设施的完善，分子生物学技术的发展和广泛应用，越来越多的实验室开始进行病毒的病原学方面的诊断和研究。对病毒的诊断除了常用的血清学检测外，还包括病毒形态学检查、病毒培养和鉴定、病毒蛋白和基因的检测。诊断方法包括病毒分离鉴定、病毒血清学、分子生物学、电子显微镜技术等。
（一）形态学检查
1.光学显微镜检查
病毒颗粒非常微小，在光学显微镜下仅能看到病毒包涵体。将各类含有组织细胞的标本，染色后在显微镜下观察包涵体，可辅助诊断病毒感染。如：疱疹病毒感染，可取黏膜、皮肤、口腔、角膜等组织细胞涂片后，Wright－Giemsa染色镜检，如发现核内包涵体及多核巨细胞，可考虑单纯疱疹病毒（HSV）感染；将疱疹液进行电镜负染后观察结果。
2.电子显微镜检查
病毒颗粒必须在电子显微镜下才能看到，常用透射电子显微镜观察各种标本中的病毒颗粒。利用电子显微镜检查病毒的方法有直接电镜检查和免疫电镜检查法。
临床标本中或培养后的病毒，常用磷钨酸盐进行负染色后，可直接在电子显微镜下检查。负染色将标本用重金属染液（磷钨酸盐）染色后，使病毒周围背景着色，电子光束能通过低电子密度的病毒颗粒，而不能通过高电子密度的重金属染液，使病毒颗粒在黑色背景中呈现出明亮、清晰的形态和结构。该法观察病毒形态直观，费用昂贵，临床标本检出率低。
临床标本直接用电镜检查，尤其是病毒颗粒数量不多时需要注意与其他细胞器和杂质进行区别，并用其他方法进行确证。临床标本和一些培养标本中的病毒颗粒少、含量低，在电镜下直接观察常难以发现，最好先用不同方法对标本中病毒颗粒进行浓缩，可提高检出率。也可采用高速离心分离浓缩病毒，或用琼脂糖或聚乙二醇等物质进行浓缩后，再行电子显微镜检查可提高病毒的阳性检出率。
另外，在电子显微镜下观察病毒颗粒的大小，有无包膜，衣壳的对称性等可初步判断病毒的种属。
（二）分离培养
病毒的分离培养在病毒性疾病的诊断是一项重要的内容。由于病毒的特异性，有些病毒（如流感病毒）容易分离培养，有些病毒较难分离，还有一些病毒至今尚无合适的体外培养方法。
目前常用的病毒分离培养方法有细胞培养、鸡胚培养和动物接种，按照病毒的特点、临床诊断和检验目的，结合各培养方法的特点，对不同来源的标本应选择最合适的方法进行分离培养和鉴定。
1.标本
最好在病程初期或急性期采集，此期标本内含病毒量多，易检出。病程后期由于机体产生了抗体，开始清除病毒，使病毒数量减少，检出率将显著降低。
（1）血液：
无菌操作抽取抗凝血10ml，如进行血清学检查则需非抗凝血5ml。全血可分离CMV和HSV，亦可用于黄病毒、EBV、HIV－1及新生儿肠道病毒的分离。检测特异性IgM可采取单份急性期血清，特异性IgG抗体检测应采取急性期和恢复期双份血清。
（2）呼吸道感染：
一般采集鼻咽洗漱液、鼻咽拭子或痰液，分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒等。
（3）肠道感染：
采集粪便或直肠拭子，用于腺病毒和轮状病毒的分离和鉴定。
（4）中枢神经系统感染：
可采集脑脊液标本进行病毒的分离。也可采咽拭子、脑膜组织分离单纯疱疹病毒，亦可采集脑脊液标本进行聚合酶链反应（PCR）检查。其他能引起中枢神经系统感染的病毒如黄病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、麻疹病毒、狂犬病病毒等可用血清学或核酸检测方法进行诊断。血清学检查用的标本，应采发病初期和恢复期双份血清标本，同时进行检查，如抗体滴度有4倍以上升高有诊断意义。
（5）其他：
心脏疾病患者可采集其咽拭子、粪便、心包液，也可采集血液进行相关病毒的分离和鉴定。先天性或新生儿感染者可采集咽喉拭子、尿液、脑脊液、皮损、血液等标本分离和PCR方法等检测相关可疑病毒。
2.标本的处理及运送
病毒喜冷怕热，在室温下很快灭活。标本应在采集后1～2小时内送实验室，立即进行检查或分离培养。如实验室距离较远或一时无法传送，应将标本放入装有冰块的冰壶内尽快送检。甘油对大多数病毒具有保护作用，送检的组织、粪便标本等可置于含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温下保存送检。暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻融使病毒灭活，存放在－70℃低温冰箱内保存。
无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗涤后制成10%～20%悬液离心后，取上清接种；含漱液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌后接种。
3.动物接种
动物接种是最原始的病毒培养方法，可用于病毒分离、鉴定、传代和制备抗血清。常用实验动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、犬、猴等，选择易感、易饲养和繁殖的健康动物，同时注意动物的年（月）龄，根据病毒对组织的亲嗜性选择接种途径，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉，常用的接种途径有颅内、鼻腔及腹腔接种等。如嗜神经病毒接种鼠脑内，接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，接种细胞培养或继续接种动物传代，并作鉴定。
4.鸡胚接种
鸡胚培养是常用的病毒培养法之一。多种病毒能在鸡胚中增殖，特别是痘病毒、黏病毒和疱疹病毒。鸡胚来源容易，组织分化程度低，操作简单，而且对接种的病毒不产生抗体；另外，病毒在鸡胚中易增殖，感染病毒的囊膜和液体中含有大量病毒，可选择适当的接种途径等优点，实验室常用鸡胚培养和分离病毒。鸡胚接种的部位有尿囊腔、羊膜腔、绒毛尿囊膜及卵黄囊等，可根据病毒的特点选择不同的接种部位。一般初次分离选用羊膜腔，传代培养多用尿囊腔。
鸡胚培养多用于可在鸡胚中生长的动物病毒的分离、培养、毒力测定，以及抗原和疫苗的制备等。
5.细胞培养
细胞培养技术是目前应用最广泛的病毒分离和培养方法。实验室常用细胞有原代细胞（如鸡胚单层细胞、人胚肾及猴肾细胞）、传代细胞（如HeLa细胞）及二倍体细胞。应根据细胞对病毒的敏感性选择细胞。
（1）原代细胞培养：
原代细胞是指用新鲜器官组织制备的单层活细胞，具有对病毒敏感但不能传代的特点。用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞即原代细胞。原代细胞不能持续传代培养，通常不用于检验诊断。常用人胚肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞，如用9～11天龄鸡胚肌皮组织制备成单个细胞悬液后，经培养可形成单层的原代成纤维细胞，对水疱性口炎病毒敏感，并可出现典型的细胞病变效应。
（2）二倍体细胞培养：
目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。
（3）传代细胞培养：
常用于病毒培养的细胞系有人宫颈癌细胞（Hela）、人喉上皮癌细胞（Hep－2）、传代非洲绿猴肾细胞（Vero）、传代地鼠肾细胞（BHK21）、传代人羊膜细胞（FL）等。根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系进行传代细胞培养已广泛用于病毒的实验室诊断。
（三）鉴定
可根据临床病史、流行病学特点以及分离病毒的标本类型、动物感染范围、细胞病变特点以及生物学特性和理化性质作出鉴定。一般临床上以观察细胞内增殖指征进行鉴定。
1.病毒在细胞内增殖的指征
有些病毒感染可引起特殊的细胞病变。
（1）细胞病变效应：
有些病毒在敏感宿主细胞内增殖，可引起细胞皱缩、变圆，出现空泡、死亡和脱落现象，称为细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）。病毒在相应细胞中增殖而出现的CPE具有特征性，通过在普通光学显微镜下观察，结合临床表现可做出诊断。此外，利用免疫荧光抗体染色法，细胞内病毒颗粒或抗原被荧光素标记的特异性抗体结合后，在荧光显微镜下查找斑点状黄绿色荧光，可鉴定病毒。此法具有快速、特异的优点。
（2）血凝和血凝抑制：
某些病毒如流感病毒和某些副黏病毒感染细胞后24～48小时，在细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，出现红细胞吸附现象，称血凝试验。若加入相应的抗血清，中和病毒血凝素后，再加入红细胞则不出现红细胞吸附现象，称为血凝抑制试验。
血凝和血凝抑制试验不仅可作为病毒增殖的指征，还可作为这类病毒的鉴定依据，如流感病毒还可测定其含量。
（3）干扰现象：
当两种病毒同时或先后感染同一细胞时，可发生一种病毒干扰另一种病毒在细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。一般是不产生CPE的病毒能干扰后进入的、能产CPE病毒的增殖，使后进入宿主细胞的病毒不再产生CPE。
2.病毒数量与感染性测定
对在细胞培养中增殖的病毒，须进行感染性和数量的测定。测定单位体积中感染性病毒的数量称为滴定。常用的测定方法和指标有：
（1）空斑测定和空斑形成单位：
有些病毒感染相应的敏感细胞后，可引起典型的细胞病变。将合适浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的培养瓶中，病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中可产生一个局限性的感染细胞病灶，并逐渐扩大；在培养细胞上覆盖一层含有活性染料（如中性红）的琼脂，37℃培养后出现不着色空斑（plaque）。每一个空斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称空斑形成单位（plaque forming unit，PFU）。单位体积中病毒的数量或病毒浓度可用PFU／ml表示。该法仅适用于能在敏感细胞上产生CPE的病毒。
（2）50%组织感染量（TCID50）测定：
50%组织感染量即半数组织感染量，是指病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。TCID50可估计病毒感染性的强弱及含量，但不能准确测定感染性病毒颗粒的数量。一般将病毒悬液作连续10倍倍比稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算TCID50。
3.病毒形态结构及理化性质测定
观察病毒的形态和检测其理化性质也是鉴定病毒的重要方法。
（1）病毒大小测定：
病毒个体非常微小，必须用特殊方法测定。
1）电子显微镜直接测量：
标本经超薄切片或粗提浓缩后，用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察测量病毒大小。
2）超滤法：
用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。
3）超速离心法：
用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究无包膜病毒结构亚单位和分子结构等。
（2）病毒核酸类型测定：
用RNA酶及DNA酶处理可鉴定病毒的核酸类型。另外，DNA病毒受氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法可区分DNA与RNA病毒。
（3）其他理化性状的检测：
对脂溶剂的敏感性：有包膜病毒（如正黏病毒、副黏病毒、反转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚；但前者可耐pH 3，而后者在pH 3～5环境中很快被灭活，可借此鉴别。
4.血清学鉴定
用已知的诊断血清鉴定病毒。补体结合试验可将病毒鉴定到科、属；中和试验或血凝抑制试验可将病毒鉴定到种、型及亚型。
（1）血凝试验和血凝抑制试验：
某些病毒或病毒表面的血凝素能与人（O型血）和鸡、豚鼠等的红细胞表面糖蛋白受体结合使红细胞发生凝集（血凝），此现象可被病毒相应抗体抑制（血凝抑制）。利用血凝和血凝抑制现象可检测病毒及其效价。血凝抑制试验中利用相应抗体与病毒结合后，可阻止病毒表面HA与红细胞结合，既可用于病毒抗体的快速检测，也可用于病毒的分型和定性分析。
血凝试验及血凝抑制试验仅针对有血凝素的病毒，如流感病毒、腺病毒、麻疹病毒、副流感病毒、部分肠道病毒等，常用于正黏病毒、副黏病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病学调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。
（2）中和试验：
特异性的抗病毒血清（中和抗体）与病毒作用后，中和抗体能破坏病毒表面的受体作用位点，从而抑制病毒对敏感细胞的吸附和侵入，使病毒失去感染的能力。根据实验对象不同，可分为敏感动物、鸡胚或培养细胞的病毒感染中和试验。中和试验以检测病毒的感染力为基础，通过比较病毒被中和抗体中和后的病毒残存感染力判断病毒的效价。用已知型别抗血清与未知病毒反应，可鉴定病毒的属和型别。中和试验也可测定免疫血清的效价以及疫苗免疫后的抗体反应；还可用于病毒抗原性分析。
5.病毒的分子生物学检测
常用的分子生物学检测技术，包括分子杂交、PCR技术及实时荧光定量PCR技术等已逐步被应用于病毒的检测。实时荧光定量PCR广泛应用于如人类免疫缺损病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人巨细胞病毒（HCMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）等病毒载量的测定，对于判断病毒的活动性感染、病毒与宿主之间的关系研究、对抗病毒治疗的反应监控等具有重要作用。
此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可对某些具有特定核酸结构的病毒，如轮状病毒、呼肠病毒等进行方便、快速的诊断。
（四）病毒的血清学诊断
病毒的血清学诊断主要指对患者血清中相应的病毒或抗体进行检测，以诊断病毒感染的方法。常用的方法有：
1.中和试验
用已知病毒或抗血清与患者血清进行中和试验，阳性可确诊。此法适合可在敏感细胞内产生CPE的病毒。
2.补体结合试验
可作为近期感染的指标。特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物后能结合补体。加定量的补体于抗原抗体的反应系统中，补体被结合，不再以游离形式存在，此时如再加入另一抗原抗体系统（羊红细胞和溶血素），则后者因缺乏游离的补体参与其溶血反应，不出现溶血，结果为阳性反应。如被测系统中没有病毒抗原或没有病毒抗体结合，在加入红细胞和溶血素系统后显现溶血，为阴性反应。补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。但本法操作烦琐，特异性较中和试验低。
3.血凝抑制试验
血凝抑制试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于检测患者或禽血清中是否有与抗原亚型一致的病毒感染或免疫抗体。
4.ELISA
在临床上被广泛应用于多种病毒抗体的检测。
五、寄生虫的检验诊断
（一）肛门周围寄生虫检验
某些带绦虫孕节可从肛门逸出，并有虫卵污染肛门周围，可用棉拭子法拭擦肛门周围检查虫卵。
（二）粪便中寄生虫检验
1.生理盐水直接涂片法
每天或隔天早晨收集新鲜粪便标本，连续3次送检。适用于蠕虫卵、原虫滋养体的检查。也可用饱和盐水法浓集虫卵，提高阳性检出率。
2.虫卵孵化法
钩虫卵在适宜温、湿度和氧气充足的情况下很快发育并孵出幼虫，可在显微镜下观察。检出率高于粪便直接涂片法和饱和盐水法。可鉴别虫种并为研究各种药物对钩虫的驱虫效果、指导治疗提供依据。成熟日本血吸虫卵内毛蚴在25～30℃、pH7.5～7.8及一定光线下，在清水中孵化4～6小时可观察到孵出的毛蚴，阳性检出率高于粪便检査虫卵的各种方法。
3.粪便中蠕虫的检查
肠道寄生的蠕虫有时能自然排出，或服用驱虫药后随粪便排出，可通过显微镜进行检査。也可通过染色后检查。
（三）排泄物与分泌物中寄生虫检验
1.痰液
痰液中能查见肺吸虫卵、棘球蚴的原头蚴、蛔蚴、钩蚴等。
2.十二指肠液和胆汁
用于检査十二指肠和肝胆系统内寄生的如华支睾吸虫卵等，以及蛔虫卵、姜片虫卵。
3.阴囊鞘膜积液
主要用于班氏丝虫微丝蚴的检查。
（四）血液寄生虫检査
血液中微丝蚴的检査：由于班氏丝虫和马来丝虫有夜现周期性的特点，故在21时至凌晨2时采集血液。采用鲜血片法、厚血片法直接在显微镜下查找。也可以采集2ml抗凝静脉血，用离心浓集方法检查。
（五）其他器官组织寄生虫检査
1.骨髓
主要检查杜氏利什曼原虫。
2.脑脊液
直接涂片法主要用于检查肺吸虫虫卵、棘球蚴等，也可检到血吸虫卵、弓形虫滋养体等，但检出率低。
3.淋巴结
用穿刺或活检的方法取得淋巴结组织。可检查丝虫的成虫或已钙化的丝虫结节。穿刺液涂片或组织切片可査见杜氏利什曼原虫和弓形虫滋养体。
4.肌肉
切取米粒大小的肌肉组织1块，作压片观察，或将肌肉组织剪碎、消化后取沉渣观察。用于囊虫病的检查。
5.直肠黏膜活组织检査
从直肠病变部位取米粒大小直肠黏膜1块，作压片检查，可直接或染色后检查血吸虫虫卵。
6.肝或肺组织
通过穿刺或手术取肝、肺组织，作涂片、压片或切片检查。肝组织可査见血吸虫虫卵、杜氏利什曼原虫等。肺组织中可查见肺吸虫成虫及棘球蚴等。
（楼永良）