第二节 肝癌的早期诊断和复发转移机制探索与技术创新

早期诊断是改善肝癌预后的最重要手段。20世纪70年代，我国上海、江苏等地就已成功应用甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）进行普查，发现大批早期肝癌病人；90年代，杨秉辉教授等指出40岁以上的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性或慢性肝炎病人为肝癌的高危对象。在该人群中进行肝癌普查的检出率较自然人群中高34.5倍，并推荐每年进行两次AFP结合B超检查。近年来，随着以磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）为代表的医学影像学的快速发展、诸多肝癌早期诊断分子标志物如甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）、异常凝血酶原（DCP/PIVKA-Ⅱ）、高尔基体蛋白73（GP73）等被广泛接受，以及以循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环微 RNA（miRNA）、循环肿瘤 DNA（ctDNA）为代表的液体活检技术飞速发展，肝癌的早诊水平又向前迈进了一大步。

肝癌的转移复发是进一步提高肝癌临床疗效的最主要障碍，近年来，对其机制进行了深入广泛的探索，以人源异种小鼠移植瘤模型等为代表的一系列新技术也获得了广泛应用，使人们对肝癌的转移复发机制有了更深一步的认识。

可以预期，在不久的将来，随着肝癌早期诊断水平的不断提高以及对肝癌复发转移机制认识的不断深化，肝癌的临床治疗水平和预后将会有明显提高，越多的病人会更加受益于科学的进步，获得更好的疗效。

一、肝癌高危人群及其监测模式

国家癌症中心报告，2014年我国肝癌新发病例数约为36.5万，发病率26.92/10万（排名第四），死亡率23.72/10万（排名第二）。男性风险为女性的2～3倍，且好发于40岁以上人群。肝癌可分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）以及肝细胞-胆管细胞混合性癌（combined hepatocellular and cholangiocarcinoma，cHCC-CC）等，其中肝细胞癌占75%～85%。

HCC的危险因素主要有慢性肝炎病毒（HBV、HCV）感染、黄曲霉素、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、乙醇摄入过量、各种原因引起的肝硬化、肥胖、吸烟、2型糖尿病及肝癌家族史等。ICC的危险因素主要有肝内胆管结石以及反复胆道感染、原发性硬化性胆管炎、先天性胆道异常、寄生虫感染、毒素暴露等，肝炎病毒感染与胆管癌发生亦存在一定联系。

由于肝癌的早期诊断和治疗是提高疗效的关键，这就需要对肝癌高危人群进行定期监测，以期早期发现肿瘤，从而提高病人接受根治性治疗的机会，最终降低死亡率、延长病人生存期。一般来说，具有上述危险因素的人群都被称为肝癌高危人群，应定期进行检查。血液学检测［如血常规、肝功能、AFP、糖类抗原19-9（CA19-9）、异常凝血酶原（DCP）、甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）］和超声诊断是目前肝癌筛查的主要手段，对于部分不能够有效明确诊断的病人可行电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）、MRI、数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）以及核医学影像检查等进一步明确病灶性质。现有资料表明，针对高危人群每半年一次筛查能有效地早期发现肿瘤，对肝癌的早诊、早治起到了非常关键性的作用。

因此，针对肝癌高危人群的定期监测是提高肝癌疗效的主要手段。但未来仍需探索更多、更加精准的肝癌早期筛查手段，以便更早、更准确地发现肝癌，进一步提高肝癌的早诊、早治比例，从而更好地改善病人的预后和生存。

二、肝癌复发转移机制探索与防治策略创新

手术仍是目前肝癌最有效的治疗手段，但即使接受根治性切除的病人，其5年复发转移率仍高达60%～70%，远期疗效令人沮丧。术后复发转移已成为阻碍肝癌病人长期生存的瓶颈与关键，临床上迫切需要探索肝癌复发转移的分子机制，寻找有效的干预靶点，提出预防肝癌复发转移的新策略。

肝癌的复发转移是一个多环节、多步骤的复杂过程。目前已知的机制包括：细胞基因和表面结构改变、局部血管生成能力增强、细胞黏附能力增强、肿瘤内局部缺氧和代谢功能改变以及肝癌细胞与局部免疫、炎症等细胞和细胞外间质之间的相互作用等。因此，肝癌的复发转移不仅与癌细胞自身高侵袭转移的生物学特性有关，肝癌微环境亦起到十分重要的促进作用。值得一提的是，通过对转移复发始动细胞的系统深入研究发现，CTC和肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）作为“种子细胞”在肝癌复发转移中扮演着极其重要的角色。

本部分重点探讨肝癌复发转移的机制，并从肝癌个体化治疗角度出发，基于肿瘤测序筛选抗肝癌药物和病人来源肿瘤移植瘤模型（patient derived xenograft，PDX）验证两大技术，进行病人精准用药领域的初步探索。

（一）免疫微环境与肝癌复发转移

2011年Cell杂志将肿瘤的“六大标志性特征”扩展为包括微环境因素在内的“十大标志性特征”，并强调肿瘤是一种“微环境疾病”，因此肿瘤微环境的重要性得到进一步提升。肝癌与慢性肝炎、肝纤维硬化等微环境因素显著相关，是最典型的“微环境”相关恶性肿瘤。肝癌侵袭转移能力不仅取决于癌细胞本身，更是“机体-微环境-癌细胞”三者互动的结果，其中微环境在肝癌发生发展中起着至关重要的作用。关于这一点，微环境免疫炎症细胞，如Treg、Th17、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞，以及各种小分子和细胞外基质，对肝癌发生发展的促进作用得到了广泛的认同。随着流式细胞术、单细胞测序等技术的进步，对微环境免疫细胞亚群的鉴定和分类变得更加精确。一项肝癌的单细胞组学研究发现，肝癌微环境中T细胞的异质性和可塑性空前复杂，至少存在11种T细胞亚群。众多研究发现，肝癌微环境免疫炎症细胞在多方面存在显著的瘤间、瘤内异质性：①肝癌微环境的可塑性：肝癌细胞通过对在组织中迁移和分化的免疫细胞进行动态编辑和驯化导致局部免疫抑制。②肝癌微环境的精确调控：个体差异明显的趋化因子及其受体表达谱决定了微环境中免疫炎症细胞的种类、浸润分布以及特异性空间分布，甚至临床预后。

肝癌术后复发转移中，80%～90%为肝内复发。不容置疑，肿瘤本身是肝癌肝内复发的主要危险因素之一，而癌周肝脏作为“土壤”，其特殊的理化性质、组织结构和免疫炎症反应，在肝癌细胞的癌周肝组织定向转移中起着重要作用。研究证实，癌周肝脏免疫炎症微环境状态影响肝癌肝内播散，癌周肝脏微环境分子病理特征可预测肝癌肝内播散；此外，肝癌细胞也可特异性诱导癌周肝组织中的肝星状细胞和免疫炎症细胞向着促癌方向发展和异常激活。根据Kaplan等提出的“转移前微环境”理论，肝癌细胞对癌周肝脏微环境可能存在一定程度的预调控。目前关于“转移前微环境”的研究大多数针对肿瘤的肺转移，这需要设计合理严密的实验来明确癌周肝组织“转移前微环境”的基因及蛋白水平的变化、骨髓干细胞聚集、炎症信号激活等一系列核心因素，来证实这一假说在肝癌肝内转移的正确性。随着单细胞组学等的技术进步和广泛应用，必将为深入理解肝癌微环境的异质性、可塑性及其促癌作用带来新的突破。

（二）循环肿瘤细胞及肿瘤干细胞与肝癌复发转移

以高复发转移潜能为核心的肿瘤生物学特性是肝癌预后差的最主要根源，是21世纪进一步提高肝癌疗效必需攻克的难题。近年来随着分子生物和细胞分选技术的发展，肝癌复发转移研究已从传统的单基因、单分子调控研究，进一步拓展为对复发转移始动细胞的系统深入研究，即CSC和CTC，这些细胞在肝癌复发转移过程中扮演着重要的“种子细胞”角色。

目前中国学者已发现并鉴定了多种肝癌CSC亚群，其中包括侧群细胞、CD133+、CD90+、OV6+、CD24+和ICAM+肝癌CSC。虽然肝癌CSC占整个肝癌细胞群体的比例不超过5%，但致瘤性极强，且具有明确的自我更新、多向分化以及更强的迁移侵袭能力。不同肝癌病人肿瘤组织内的CSC亚群存在高度异质性，其分子标志物表达可作为肝癌复发转移独立预测因子。复旦大学附属中山医院通过深入研究肝癌CSC亚群，取得了一系列成果：①鉴定了可用于预测肝癌病人预后的肿瘤分子标志物。②发现使用Hedgehog信号通路抑制剂NanoHHI或钙通道靶向单抗1B50-1可有效抑制肝癌细胞的自我更新、分化、增殖、侵袭转移以及肝癌CSC在小鼠体内的成瘤能力，为肝癌CSC的靶向治疗提供了实验和理论依据。③首次从肝癌病人外周血中成功分离出具有干细胞样特性的CTC并证明了其高致瘤性。肝癌病人术前外周血中的CTC数量是肝癌根治性切除术后的早期复发独立预后因子，而监测术后CTC数量动态变化可提前预警肝癌复发转移的发生。④首次报道全身免疫炎症状态可促进CTC播散转移，揭示了系统炎症和免疫平衡状态与肝癌复发转移的内在联系。此外，复旦大学附属中山医院最新研发的CTC分子检测试剂盒已获得国家发明专利（ZL201410081508.9），该试剂盒能够富集循环中异质性CTC、实现外周血微量CTC多基因和分子的检测。使用该试剂盒结合CTC多标志物，复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科团队完成近千例肝癌CTC检测，结果证明该试剂盒检测CTC可实现肝癌的早期诊断和转移复发预测；可对肝癌手术切除后、经导管肝动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）治疗后及放疗后肿瘤复发和进展的预测；动态监测CTC变化相比传统影像学检查能够更好地反映抗肿瘤治疗的效果，具有更高临床价值。值得说明的是，CTC异质性的检测仍是目前CTC研究中需要重点解决的问题，而核酸适配体纳米芯片、纳米磁珠和微流控抗体芯片等CTC富集新方法为高效的肝癌CTC分选提供了创新的技术思路。

（三）肝癌病人来源的异种移植瘤小鼠模型及其构建

近年来，虽然抗肿瘤药物研究不断取得新进展。但不幸的是，尽管超过90%的新药在动物模型上展示出喜人的抗癌效果，但Ⅲ期临床试验却未达主要终点。这提示抗肝癌新药研发需更深入了解肝癌的生物学特性。现有细胞系肿瘤模型（cell line-derived xenografts，CDX）无法满足这一要求的主要原因在于：①CDX无法代表病人的个体多样性。②经过长期体外处理和传代，细胞系组织及遗传学特征发生较大改变。③细胞系无法反应肿瘤异质性与微环境。

PDX是将手术或活检等方式获得的病人肿瘤组织接种于免疫缺陷小鼠所建立的肿瘤动物模型。2016年初，美国国家癌症研究所（NCI）宣布用PDX代替NCI-60细胞系用于癌症研究，其优势可见一斑。首先，PDX不经体外培养过程的筛选，能最大限度地保留复杂的瘤内生物学特性及完整的肿瘤异质性，同时可以再现肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用。其次，PDX能准确反映临床药效。PDX模型和与其对应的肿瘤病人对照研究显示，两者药效一致性高达90%。最后，PDX模型能再现肿瘤进化演变过程。克隆演变是连续性过程，PDX模型肿瘤生长、传代过程恰好可以反映肿瘤复杂的克隆动力学，为研究肿瘤复发转移提供了绝佳对象。当然PDX模型也有药敏检测通量低、价格高、时间长等缺点。此外，由于PDX模型缺少人源免疫系统，无法应用于免疫药物的基础及临床研究。

近年来，复旦大学附属中山医院从不同角度聚焦PDX研究，创造性建立了肝癌PDX模型标准化构建流程（授权专利：ZL201410100264.4），大幅度提高了成瘤率；同时确定最优冻存液配伍方案，使得冻存后复苏率达98%以上。将上述模型及PubMed数据库可查肝癌PDX相关信息逐步录入自主建立的数据库。该数据库是目前可查的最大的肝癌PDX数据库：涵盖116例肝癌PDX临床、病理、药敏、基因表达、种系突变、体细胞突变和拷贝数改变等信息并可预测索拉非尼药物敏感情况。该数据库契合大数据时代信息共享理念，为国内外PDX研究者、药物研发人员提供一种有效的查询、分析工具。利用上述PDX模型，复旦大学附属中山医院樊嘉院士和中国人民解放军军事医学科学院贺福初院士团队共同证明固醇O-酰基转移酶（SOAT1）的一种小分子抑制剂阿伐麦布（avasimibe）具有良好的抗肿瘤效果，有望成为治疗预后较差肝细胞癌病人的药物，该研究结果于2019年发表在Nature上。

三、肝癌早期诊断技术的研发与探索

肝癌的早诊、早治是提高病人长期生存的关键。肝癌的早期诊断主要依靠影像学、血液学检测AFP和组织检测，但早期肝癌诊断的特异度和灵敏度仍待提高。目前我国对早期诊断的研究与探索主要集中在影像学检查及分子标志物检测两个方向。

影像学早期诊断的方法主要包括超声检查、磁共振成像和X线计算机断层成像。超声检查简便、无创，是目前临床上最常用的肝癌诊断方法。而超声造影术，腹部磁共振及CT成像在鉴别和诊断肝癌的良、恶性方面具有较普通超声检查更高的准确度。通过各种影像学检查的综合应用，大大提高了早期肝癌的检出率。

近年来，肝癌早期诊断分子标志物的研究特别是液体活检取得较大的进展。相对于传统组织活检而言，液体活检技术更全面、更便捷，并且可以实现肿瘤的动态监测和早期筛查。特别是cfDNA甲基化/羟甲基化（5hmC）及微小核糖核酸，在肝癌的早期诊断中已显示出超越甲胎蛋白，有更高的敏感度和特异度，更适合肝癌的筛查和早期诊断。

迄今为止，甲胎蛋白仍是临床中诊断肝细胞癌重要的标志物之一。除此之外，还有许多有前景的肝癌早期诊断分子标志物，如甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）、异常凝血酶原（DCP）和高尔基体蛋白73（GP73）等诊断的敏感度或特异度甚至超过了AFP。

AFP-L3是肝癌细胞特异性蛋白，常用AFP-L3与AFP的百分比作为HCC早期诊断的标志物。肝癌病人AFP-L3占总AFP的比例常常超过20%，而良性肝病AFP-L3与AFP的比例则较低。在一些亚洲国家（如日本、韩国及印度），DCP也被作为HCC的常规分子标志物。

正常人的肝细胞中GP73表达量极低甚至不表达，然而在肝癌病人血清中显著升高。北京协和医院毛一雷教授通过大样本量（n=4 217）多中心研究发现GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到74.6%和97.4%，提示GP73可作为早期肝癌的诊断分子标志物。

热休克蛋白90α（Hsp90α）是一种高度保守的蛋白，肝癌病人外周血中Hsp90α含量显著升高，并且与肿瘤恶性和转移能力呈正相关。清华大学罗永章教授通过一项大样本（n=1 647）多中心临床研究发现血浆Hsp90α诊断早期肝癌的敏感度和特异度分别为92.4%和90.3%，高于作为对照的AFP。值得注意的是GP73和Hsp90α是泛肿瘤的标志物，在许多其他肿瘤病人体内也会升高。

DKK1（Dickkopf-1）是一种分泌蛋白，在人类多种肿瘤包括肝癌中特异高表达。上海市肿瘤研究所覃文新发现，血清DKK1蛋白对肝细胞癌总体诊断的敏感性可达69.1%、特异性为90.6%。特别是对早期肝细胞癌（BCLC 0+A）和微小肝癌（单个＜2cm）的诊断敏感性分别可达70.9%和58.5%、特异性分别为90.5%和84.7%，是一种有前景的早期诊断分子标志物。

大量研究表明，miRNA广泛参与肿瘤的发生发展及复发转移。miRNA能够抵抗RNA酶的降解，从而能稳定存在外周血中，是一种理想的分子标志物。复旦大学附属中山医院樊嘉院士团队采用高通量芯片从多中心、大样本量病人血浆中筛选到7个肝癌相关的miRNA，并建立了可用于肝癌早期诊断的模型，其敏感性和特异性均达80%以上。目前基于该模型开发出的肝癌微小核糖核酸检测试剂盒已获多个国家和地区的授权发明专利，作为NMPA批准的首个核酸类肝癌体外诊断试剂盒，即将在全国20个地区应用。

ctDNA在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约20ng。通过检测少量的血液ctDNA特定位点甲基化水平，不但能将肝癌早期诊断敏感性从60%提升到84.9%，而且还能够通过甲基化水平的变化来准确预测不同病人的生存和预后情况。最近几年快速发展的5hmC在临床研究特别是液体活检中显示了突出的优秀性能，其在多种肿瘤组织中的含量明显较低。5hmC水平的高低与肿瘤的类型及临床分期也有着密切的关系。基于化学捕获的5hmC检测技术是一种新的液体活检技术，利用高通量测序并比对分析的方法可获得更为精确的5hmC的基因图谱。利用该技术，有望克服目前液体活检CTC、ctDNA敏感性和特异性不够高的缺陷。樊嘉院士和王红阳院士共同通过检测血液中游离DNA的羟甲基化水平建立的5hmC模型能准确区分早期肝癌和非肿瘤病人。中山大学徐瑞华教授团队完成的一项筛选ctDNA甲基化诊断肝癌的研究，通过收集来自377份肿瘤标本和754个健康人血清样本的ctDNA甲基化位点资料，提取ctDNA，从48.5万个候选位点中获取了10个早期诊断和疗效相关的位点。随着分子生物学、免疫学的进步，循环肝癌分子标志物也由传统的蛋白质分子标记扩展到核酸类分子标志物。目前许多新的分子标志物已经获得NMPA的三类医疗器械批准应用到临床，有望进一步提高肝癌的早诊早治率，从而更好地改善病人预后。

（高强　胡博　胡捷　孙云帆　蔡加彬　周佩云　邱双健　周俭）

参考文献

［1］杨秉辉，任正刚.我国肝癌研究的进展［J］.中国肿瘤，1993，2（9）：23-25.

［2］杨秉辉，刘康达，汤钊猷.在高发人群中普查肝癌的初步研究［J］.肿瘤，1987，7（2）：82-83.

［3］杨秉辉，汤钊猷.我国肝癌普查的现状与不足［J］.肿瘤防治研究，1991，18（4）：199-201.

［4］郑荣寿，孙可欣，张思维，等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析［J］.中华肿瘤杂志，2019，41（1）：19-28.

［5］SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A.Cancer statistics，2019［J］.CA Cancer JClin，2019，69（1）：7-34.

［6］EASL Clinical Practice Guidelines：Management of hepatocellular carcinoma［J］.JHepatol，2018，69（1）：182-236.

［7］BRUIX J，REIG M，SHERMAN M.Evidence-based diagnosis，staging，and treatment of patients with hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2016，150（4）：835-853.

［8］ZHANG H，SHEN F，HAN J，et al.Epidemiology and surgical management of intrahepatic cholangiocarcinoma［J］.Hepat Oncol，2016，3（1）：83-91.

［9］RIZVI S，GORESG J.Pathogenesis，diagnosis，and management of cholangiocarcinoma［J］.Gastroenterology，2013，145（6）：1215-1229.

［10］HANAHAN D，WEINBERG R A.Hallmarks of cancer：the next generation［J］.Cell，2011，144（5）：646-674.

［11］邱双健，樊嘉.肝癌微环境研究对肝癌诊治的启示［J］.医学与哲学，2011，32（12）：16-18.

［12］ZHENG C，ZHENG L，YOO JK，etal.Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing［J］.Cell，2017，169（7）：1342-1356.

［13］DUAN M，GOSWAMIS，SHI JY，et al.Activated and exhausted MAIT cells foster disease progression and indicate poor outcome in hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2019，25（11）：3304-3316.

［14］MA L J，FENG F L，DONG L Q，et al.Clinical significance of PD-1/PD-Ls gene amplification and overexpression in patientswith hepatocellular carcinoma［J］.Theranostics，2018，8（20）：5690-5702.

［15］GAO Q，QIU S J，FAN J，et al.Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection［J］.JClin Oncol，2007，25（18）：2586-2593.

［16］GAO Q，ZHAO Y J，WANG X Y，et al.CXCR6 upregulation contributes to a proinflammatory tumormicroenvironment that drivesmetastasis and poor patient outcomes in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2012，72（14）：3546-3556.

［17］LIU L Z，ZHANG Z，ZHENG B H，et al.CCL15 recruits suppressive monocytes to facilitate immune escape and disease progression in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2019，69（1）：143-159.

［18］ZHOU S L，DAI Z，ZHOU Z J，et al.Overexpression of CXCL5 mediates neutrophil infiltration and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2012，56（6）：2242-2254.

［19］ZHU X D，ZHANG J B，ZHUANG P Y，et al.High expression of macrophage colony-stimulating factor inperitumoral liver tissue is associated with poor survival after curative resection of hepatocellular carcinoma［J］.JClin Oncol，2008，26（16）：2707-2716.

［20］SHIJY，YANG L X，WANG Z C，et al.CC chemokine receptor-like 1 functions as a tumour suppressor by impairing CCR7-related chemotaxis in hepatocellular carcinoma［J］.JPathol，2015，235（4）：546-558.

［21］CHEN D P，NINGW R，LIX F，et al.Peritumoral monocytes induce cancer cell autophagy to facilitate the progression of human hepatocellular carcinoma［J］.Autophagy，2018，14（8）：1335-1346.

［22］CHEN D P，NING W R，JIANG Z Z，et al.Glycolytic activation of peritumoral monocytes fosters immune privilege via the PFKFB3-PD-L1 axis in human hepatocellular carcinoma［J］.JHepatol，2019，71（2）：333-343.

［23］KAPLAN R N，RAFII S，LYDEN D.Preparing the “soil”：the premetastatic niche［J］.Cancer Res，2006，66（23）：11089-11093.

［24］SHIG M，XU Y，FAN J，et al.Identification of side population cells in human hepatocellular carcinoma cell lines with stepwise metastatic potentials［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（11）：1155-1163.

［25］ZHU Z，HAO X，YAN M，et al.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma［J］.Int JCancer，2010，126（9）：2067-2078.

［26］YANG Z F，HO DW，NG M N，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

［27］YANGW，WANG C，LIN Y，etal.OV6（+）tumor-initiating cells contribute to tumor progression and invasion in human hepatocellular carcinoma［J］.JHepatol，2012，57（3）：613-620.

［28］LEE T K，CASTILHO A，CHEUNG V C，et al.CD24（+）liver tumor-initiating cells drive self-renewal and tumor initiation through STAT3-mediated NANOG regulation［J］.Cell Stem Cell，2011，9（1）：50-63.

［29］LIU S，LIN，YU X，et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells［J］.Gastroenterology，2013，144（5）：1031-1041.e10.

［30］YANG X R，XU Y，YU B，et al.High expression levels of putative hepatic stem/progenitor cell biomarkers related to tumour angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Gut，2010，59（7）：953-962.

［31］XU Y，CHENNA V，HU C，et al.Polymeric nanoparticle-encapsulated hedgehog pathway inhibitor HPI-1（NanoHHI）inhibits systemicmetastases in an orthotopicmodel of human hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2012，18（5）：1291-1302.

［32］ZHAOW，WANG L，HAN H，et al.1B50-1，amAb raised against recurrent tumor cells，targets liver tumorinitiating cells by binding to the calcium channel alpha2delta1 subunit［J］.Cancer Cell，2013，23（4）：541-556.

［33］SUN Y F，XU Y，YANG X R，et al.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection［J］.Hepatology，2013，57（4）：1458-1468.

［34］YANG Z F，NGAIP，HO DW，et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer［J］.Hepatology，2008，47（3）：919-928.

［35］FAN ST，YANG Z F，HO DW，et al.Prediction of posthepatectomy recurrence of hepatocellular carcinoma by circulating cancer stem cells：a prospective study［J］.Ann Surg，2011，254（4）：569-576.

［36］QIL N，XIANG B D，WU F X，et al.Circulating tumor cells undergoing EMT provide ametric for diagnosis and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2018，78（16）：4731-4744.

［37］HU B，YANG X R，XU Y，et al.Systemic immune-inflammation index predicts prognosis of patients after curative resection for hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2014，20（23）：6212-6222.

［38］GUO W，YANG X R，SUN Y F，et al.Clinical significance of EpCAM mRNA-positive circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma by an optimized negative enrichment and qRT-PCR-based platform［J］.Clin Cancer Res，2014，20（18）：4794-4805.

［39］GUOW，SUN Y F，SHEN M N，et al.Circulating tumor cellswith stem-like phenotypes for diagnosis，prognosis，and therapeutic response evaluation in hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2018，24（9）：2203-2213.

［40］WANG S，ZHANG C，WANG G，et al.Aptamer-mediated transparent-biocompatible nanostructured surfaces for hepotocellular circulating tumor cells enrichment［J］.Theranostics，2016，6（11）：1877-1886.

［41］CHEN L，WU L L，ZHANG Z L，et al.Biofunctionalized magnetic nanospheres-based cell sorting strategy for efficient isolation，detection and subtype analyses of heterogeneous circulating hepatocellular carcinoma cells［J］.Biosens Bioelectron，2016，85：633-640.

［42］ROBERTS T G，GOULART B H，SQUITIERIL，et al.Trends in the risks and benefits to patientswith cancer participating in phase 1 clinical trials［J］.Jama，2004，292（17）：2130-2140.

［43］REICHERT J M，WENGER J B.Development trends for new cancer therapeutics and vaccines［J］.DrugDiscov Today，2008，13（1-2）：30-37.

［44］SIOLASD，HANNON G J.Patient-derived tumor xenografts：transforming clinical samples intomousemodels［J］.Cancer Res，2013，73（17）：5315-5319.

［45］TENTLER JJ，TAN A C，WEEKESCD，et al.Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development［J］.Nat Rev Clin Oncol，2012，9（6）：338-350.

［46］BYRNE A T，ALFEREZ D G，AMANT F，et al.Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts［J］.Nat Rev Cancer，2017，17（4）：254-268.

［47］IZUMCHENKO E，MEIR J，BEDIA，et al.Patient-derived xenografts as tools in pharmaceutical development［J］.Clin Pharmacol Ther，2016，99（6）：612-621.

［48］KHOR TO，ZVI I B，KATZ A，et al.Abstract 3219：A patient-centric repository of PDX models for translational oncology research［J］.Cancer Res，2015，75（15 Supplement）：3219.

［49］APARICIO S，HIDALGO M，KUNG A L.Examining the utility of patient-derived xenograftmouse models［J］.Nat Rev Cancer，2015，15（5）：311-316.

［50］KATO S，KURZROCK R.An avatar for precision cancer therapy［J］.Nat Biotechnol，2018，36（11）：1053-1055.

［51］HU B，LIH，GUOW，et al.Establishment of a hepatocellular carcinoma patient-derived xenograft platform and its application in biomarker identification［J］.Int JCancer，2020，146（6）：1606-1617.

［52］HE S，HU B，LIC，et al.PDXliver：a database of liver cancer patient derived xenograftmouse models［J］.BMC Cancer，2018，18（1）：550.

［53］JIANG Y，SUN A，ZHAO Y，et al.Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma［J］.Nature，2019，567（7747）：257-261.

［54］CROWLEY E，DINICOLANTONIO F，LOUPAKISF，et al.Liquid biopsy：monitoring cancer-genetics in the blood［J］.Nat Rev Clin Oncol，2013，10（8）：472-484.

［55］MAO Y，YANG H，XU H，et al.Golgi protein 73（GOLPH2）is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Gut，2010，59（12）：1687-1693.

［56］FU Y，XU X，HUANG D，et al.Plasma heat shock protein 90alpha as a biomarker for the diagnosis of liver cancer：An official，large-scale，andmulticenter clinical trial［J］.EBio Med，2017，24：56-63.

［57］SHEN Q，FAN J，YANG X R，et al.Serum DKK1 as a protein biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma：a large-scale，multicentre study［J］.Lancet Oncol，2012，13（8）：817-826.

［58］ZHOU J，YU L，GAO X，et al.Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］.JClin Oncol，2011，29（36）：4781-4788.

［59］SONG C X，SZULWACH K E，FU Y，et al.Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine［J］.Nat Biotechnol，2011，29（1）：68-72.

［60］SONG C X，CLARK TA，LU X Y，et al.Sensitive and specific single-molecule sequencing of5-hydroxymethylcytosine［J］.Nat Methods，2011，9（1）：75-77.

［61］CAIJ，CHEN L，ZHANG Z，et al.Genome-widemapping of 5-hydroxymethylcytosines in circulating cell-free DNA as a non-invasive approach for early detection of hepatocellular carcinoma［J］.Gut，2019，68（12）：2195-2205.

［62］XU R H，WEIW，KRAWCZYK M，et al.Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Nat Mater，2017，16（11）：1155-1161.