第二节 器官保存
一、器官保存损伤的原理
在器官移植中，器官的保存是非常重要的一部分，器官保存的手段影响着器官的质量，进而对术后的疗效影响巨大。良好的保存技术可以使器官能够运输更远的距离。目前标准肝保存要求是静态低温保存。近年来机械灌注的出现及发展不断冲击着现有的保存标准，甚至可能在今后取代静态保存技术。
移植物保存过程中可能发生“保存损伤”。不同程度的保存损伤可导致肝功能轻度异常直至完全的器官功能衰竭。器官保存损伤发生于器官保存的前、中、后三个阶段。在DBD中，肝损伤包括四个方面：保存前损伤、低温保存损伤、复温损伤和再灌注损伤，DCD还有一个热缺血损伤的过程，即心脏停搏后和灌注液灌注前的一段时间。所有时段的损伤累积并在再灌注期显著地表现了出来。同时，受者自身血流动力学问题导致灌注不良将加重损伤。
（一）保存前损伤
保存前损伤是指器官原有的或冷保存液灌洗前产生的损伤。潜在的损伤来源为：器官原有疾病；心肺功能暂停或低血压导致的损伤；器官获取时的损伤；捐献时热缺血损伤。
1.原有脏器疾病
以肝脏为例，常见的如脂肪变性，常与肥胖症、药物性或酒精性肝炎相关。脂肪变性加重了肝细胞和窦内皮细胞的冷保存损伤，并加重再灌注时的损伤，从而加重了移植后移植物失功或者功能异常的风险。实验显示脂肪变性可以影响肝动脉和微血管的循环，大泡性脂肪性变是移植物无功能、功能异常和术后胆道并发症的危险因素。轻度大泡性脂肪变性（<30%）可进行移植，但中度大泡性脂肪变性（30%～60%）和重度脂肪变性（>60%）仍会给移植带来巨大风险。药物和大量饮酒可能为供者死亡的原因，这些情况下必须考虑其对肝的潜在损害。诊断原有肝脏疾病是供器官评价的一部分。筛查供者可能的病史、体格检查、药物毒性实验、肝功能检测、肝活检可以排除大多数的肝脏原有损伤，但并不能发现所有肝脏损伤。
2.心肺功能暂停或者低血压导致的损伤
创伤导致的脑死亡常伴随低血压或低氧血症，导致肝脏热缺血。很大部分供者可能存在休克、药物中毒、心血管事件或呼吸暂停导致的心肺功能暂停。在心肺复苏前经历过长时间心肺功能暂停的患者都存在热IRI，并导致供器官受损甚至无法使用。此外，脑死亡患者在器官捐献前也会经历一些生命体征不理想的状态（如低血压）。由于一些供者在重症监护病房（intensive care unit，ICU）的时间较长导致营养不良也可损伤肝脏。这期间可能发生肝糖原的降解和其他潜在的有害代谢过程。肝脏的糖原消耗导致肝脏难以耐受无肝期及之后的热缺血。
3.器官获取时的损伤
虽然在切取过程中低血压并不常见，但其发生可能会导致损伤。有1/3的供者存在保存前损伤，表现为在切取供器官时的活检标本中可见血小板黏附于肝窦间隙内皮细胞。这一类型损伤与移植物无功能显著相关。
4.捐献时热缺血损伤
和DBD不同，DCD在撤出生命保障系统后还有非常重要的一种获取前损伤，与心肺功能暂停后的热缺血损伤相关。生命保障系统撤离后的热缺血损伤有两种。拔管后的热缺血以低灌注和组织缺氧为主要特征，随后伴有心脏停搏的热缺血。研究发现移植物无功能和供者拔管到心脏停搏的时间长短和拔管后的低血压、低氧血症的持续时间相关。如果热缺血时间超过30分钟，很多中心选择不进行脑死亡患者肝脏获取。
（二）低温保存损伤
冷保存是当前标准的器官保存方法。肝脏在冰中保存的最终温度为1℃，如果肝脏保存于液体后置于冷藏库则最后的温度为4℃。器官通过冷保存来降低代谢率，减少在保存期间对氧气及营养灌注的能量需求。
起初，冷保存对肝脏的损伤称为经典冷损伤，对所有的细胞（肝细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞）都产生影响。随后的研究表明损伤的主要机制为一种特殊的肝脏细胞——肝窦间隙内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，HSEC）的损伤，其是受低温影响最大的细胞，因此也是低温损伤的主要因素。有足够的证据显示低温保存时间越长，肝移植效果越差。
1.低温导致酶活性降低
在静态低温保存中，肝脏核心温度接近0℃。由于在保存期间无氧气和营养物质的供应，低温保存的核心就是抑制器官的代谢过程。其原理是温度每降低10℃，酶活性减少50%，称范托夫定律（van’t Hoff law）。4℃下器官的代谢能力相当于正常体温（37℃）下的10%。
2.低温导致细胞肿胀
细胞膜上钠钾ATP酶（Na+，K+-ATPase）可保证细胞内外渗透压平衡，在低温时，Na+，K+-ATPase的功能几乎消失，使得细胞内外Na+、K+比例失调，导致Na+流入细胞内。同时细胞内的负电状态加剧了Na+内流。因此导致细胞内高渗状态，引起细胞水肿，甚至裂解。这些称为经典的冷效应。Collins液和UW液被设计用来对抗这些效应。
3.缺血的病理生理
尽管器官的冷保存降低了能量代谢的需求，但也同时产生了许多有害的作用。代谢虽然减低了，但并未停止，腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）持续以低速被消耗。新的ATP的唯一来源是糖的无氧酵解（与有氧的糖酵解相比效率极低）。糖的无氧酵解导致了细胞内乳酸酸中毒。ATP的利用速度超过其新产生的速度，因此ATP被耗竭。正常情况下，ATP由腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）再生，但是如果没有足够的能量，ADP和AMP将被降解为腺苷，并离开细胞。进一步降解产生了黄嘌呤和次黄嘌呤。缺血也促进了黄嘌呤氢化酶转化为黄嘌呤氧化酶。该反应的一种产物是过氧化离子，属于活性氧类家族的一种。在保存的过程中缺乏氧分子，因此这一过程进行得相当缓慢，但是，再灌注时供氧，氧自由基通过上述机制大量产生。氧自由基对细胞膜有很强的毒性作用。
低温缺血的另一个损伤是细胞内Ca2+的积累。细胞内Ca2+积累是很多缺血过程的标志性结果，并引起细胞死亡。在生理状态下，胞外Ca2+浓度（1～2mmol/L）是胞内Ca2+浓度（0.000 1mmol/L）的100 00倍。这种浓度差是细胞膜上Ca2+转运酶和钠钙交换的结果，两者都需要能量支持。与Na+，K+-ATPase一样，在低温条件下这两种酶均因为ATP缺乏而丧失功能，从而导致大量内流，引起细胞内Ca2+累积。其他的影响因素包括细胞内Ca2+库外流。细胞内Ca2+浓度增加引起Ca2+相关的磷脂酶和蛋白酶激活，从而损伤细胞膜和细胞结构。这些酶不需要ATP的存在，因此ATP缺失对其影响不大。这些最终导致细胞完整性受损，引起细胞死亡。
4.肝窦间隙内皮细胞的损伤
肝血窦内衬有一层极薄的内皮覆盖在肝细胞血窦腔面微绒毛上，血窦内皮细胞扁平，有核部稍厚，胞质内细胞器较少。其对肝血窦与肝细胞之间的物质交换起重要作用。一些针对HSEC的研究证明，发生在保存阶段的肝损伤是来自于HSEC的损伤。肝移植冷冻保存18小时后，用碘化丙啶（PI）核染色证实HSEC损伤是明显的，当时间延长到24小时后，内皮细胞明显水肿，胞质内有许多空泡形成，自噬小体出现，有些内皮细胞膜出现中断、变形的现象。冷保存期间显著的内皮损伤似乎是肝IRI的早期关键事件，其可引起移植物微循环障碍、血小板活化、持续血管收缩和黏附分子上调，以及肝巨噬细胞活化，中性粒细胞浸润导致后续的细胞死亡。
（三）复温的损伤
供者肝血管吻合重建的时间通常为30～60分钟。在这一段时间内供者被逐渐复温但无血流灌注，因此继续在缺氧条件下通过糖的无氧酵解产生ATP。40分钟后，肝脏的中心温度可以从2℃升高到20℃，酶的活性及代谢率随之提高。在这一温度下，储存的肝糖原快速消耗，增加无氧糖酵解来满足代谢的需求。在缺氧时间相同的条件下，20℃以上所产生的损伤比低温更为严重。由复温产生的损伤与其持续时间成几何级数增长。长时间的复温缺血（>120分钟）可能直接导致原发性移植物无功能。
（四）再灌注损伤
恢复血流灌注后各种类型的缺血对肝脏的损伤在临床上表现出来。再灌注损伤有两个阶段：①再灌注后瞬间的组织损伤。②免疫系统激活引起的损伤，再灌注后的瞬间组织损伤发生在再灌注后几秒到最终导致微循环障碍和血管内血栓（无灌流现象）。早期损伤发生在几分钟时间内。这阶段损伤主要是线粒体损伤和细胞死亡，以及血小板和淋巴细胞的附着，并引起免疫炎症反应，从而加重了组织损伤并引起细胞死亡。再灌注之后，实质细胞在冷缺血和热缺血期间的损伤被再次富氧而加重。在冷缺血和早期再灌注期间线粒体的损伤导致细胞不能产生足够的ATP。再次富氧后大量氧的消耗使得线粒体产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）离子。ROS和RNS对线粒体的损伤多种多样，可引起线粒体蛋白，如电子传递链（electron transport chain，ETC）的不可逆性氧化、线粒体膜的过氧化和线粒体及细胞DNA的氧化。这些导致线粒体膜通透性改变、线粒体肿胀和膜破裂。
受者本身的因素也影响了再灌注时期的结局。例如，受者再灌注时低血压，移植物可经历低血压造成的热缺血，如果受者血小板或白细胞被激活，或炎性介质水平升高，可能产生混合损伤。在动物实验中，门静脉阻断时间延长，可导致小肠内毒素释放，肝巨噬细胞的活化，释放出肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），并产生类似休克的全身性症状（休克综合征）。
1.再灌注级联反应
IRI是由许多细胞和可溶性因子参与的、非常复杂的过程。ROS、TNF、细胞质内钙浓度升高、钙蛋白酶，均已被证实起重要作用。肝巨噬细胞的活化引发一系列炎性因子释放起到了启动作用。
目前将IRI分为两相，Ⅰ相损伤以肝巨噬细胞介导为主，而Ⅱ相损伤以中性粒细胞介导为主。Ⅰ相损伤是因肝巨噬细胞激活释放大量活性氧及细胞炎性因子造成的肝细胞急性损伤。Ⅱ相损伤发生于Ⅰ相损伤之后，是由于炎性因子的活化释放激活了炎性反应通路，大量活化的中性粒细胞在肝脏内聚集、黏附，通过释放氧自由基、蛋白酶等对肝脏造成损害，其聚集、黏附还可因阻塞肝窦造成肝窦狭窄，加重肝脏微循环障碍，引起肝细胞损害甚至损伤肝功能。
2.线粒体损伤和细胞死亡
线粒体是细胞代谢的中心场所，线粒体的正常呼吸功能和ATP生成对组织器官功能及保持细胞结构的完整性至关重要。但线粒体对缺血、缺氧非常敏感，缺血、缺氧的肝组织在血流恢复或复氧后其损伤度不但没有改善，反而进一步加重，这与细胞钙超载、氧自由基等因素有直接的关系。线粒体以缺血、缺氧、能量供应中断为始动因素，经细胞钙超载、氧自由基形成及白细胞浸润三个重要环节，通过细胞因子炎性介质的释放，对缺血肝脏造成损伤。因为pH变化、氧化应激、钙超负荷引起线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的突然开放。pH恢复、钙超载和在再灌注开始时的ROS暴发而引起的持续的MPTP开放，导致细胞生物学功能不可逆地改变。持续的MPTP开放导致线粒体渗透性增加，离子和大致1.5kD分子量的溶质渗透线粒体膜，最终引起线粒体膜电位的崩解。紧接着ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又称辅酶Ⅰ）消耗迅速，线粒体钙累积释放，基质肿胀和线粒体外膜破裂，从而导致吡啶核苷酸的损失，促凋亡因子的释放，进一步抑制电子链的传输。
3.内皮损伤
肝缺血再灌注期间钙超载、能量缺乏及氧自由基的大量形成共同导致血管内皮细胞损伤从而引起内皮功能紊乱，血管内皮细胞可合成释放一氧化氮（NO）和前列环素等对其本身有重要的保护作用。肝缺血再灌注期间，NO和前列环素合成、释放明显减少。使其对自由基、内皮素及血栓素A2的拮抗作用削弱，致使血管保护作用减弱，进一步加重血管内皮损伤，形成恶性循环，共同导致损伤的发生发展。
在早期再灌注过程中，HSEC表面的活化和之后血小板与淋巴细胞的附着是HSEC损伤的主要原因。这导致了一种炎症环境，并引发了新的炎症反应。冷缺血导致HSEC释放的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）被ROS/RNS激活。这些酶可以降解保护内皮细胞的基质。再灌注后血小板的附着也受血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和细胞黏附分子P选择素（P-selectin）的激活。这两种分子都储存在HSEC的怀布尔-帕拉德小体（Weibel-Palade body，W-P body）和血小板颗粒中，在再灌注时被迅速分泌释放。未被激活的血小板在附着到vWF上后也会被激活。
再灌注期间淋巴细胞也附着在HSEC上并引起损伤。淋巴细胞和HSEC的结合主要被细胞间黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）和P选择素介导。内皮细胞表面的ICAM-1在再灌注后30～60分钟表达量迅速升高。
4.损伤相关的分子机制
目前研究认为，IRI的机制主要包括钙稳态的失调、活性氧和氮的生成、人体微环境的改变、肝巨噬细胞的活化、补体的活化。这些机制均可导致各类损伤相关模式途径的激活，从而造成肝脏组织及功能的损伤。
5.免疫系统导致的损伤
免疫细胞激活进而诱发炎症反应在IRI发生发展中起到关键作用。实质肝细胞的IRI导致损伤相关分子模式DAMP（damage associated molecular patterns，DAMP）介导的免疫损伤引起进一步的组织受损。这一机制包括两个不同但是互补的免疫系统反应：受者本身的初始免疫反应激活了随后的获得性免疫反应，引起移植物损伤。实验证实Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）是肝脏IRI的早期介导者，肝脏驻留免疫细胞如肝巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）在损伤相关分子模式如高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）或DNA/RNA的刺激下释放细胞因子和趋化因子，激活T淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，形成炎症反应，加重组织损伤。
6.活性氧离子和离子的参与
器官血液循环中断后，细胞能量合成锐减，组织中的能量肌苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）根据氧和底物贮存量以不同速率耗竭，恢复血流后，氧的供给通过多种途径产生自由基，并能触发自由基链式反应，加重对移植器官的损害。其产生机制及有害作用包括呼吸链脱节，多核白细胞、巨噬细胞的呼吸暴发，细胞内钙离子超载以及清除自由基的能力下降等方面。再灌注期产生的白三烯、血小板激活因子使白细胞浸润，黏附于内皮细胞，产生大量氧自由基，内皮细胞受到氧自由基攻击，通透性增加肝窦变窄，肝脏微循环血流减少。
ROS/RNS对于细胞的多种成分，如蛋白质、膜磷脂和DNA有很强的毒性，同时也是IRI的介导信号，直接损伤内皮细胞的糖基质。活化的中性粒细胞再灌注早期结合在内皮细胞，在再灌注后期作为初始免疫反应的应答，均产生ROS和RNS，从而引起了再灌注早期和后期的组织损伤。
二、保存的要点
（一）低温
在缺氧条件下，低温是器官保存的重要措施。在器官获取过程中，通过动静脉灌入低温保存液使器官实现降温。同时在肝脏表面和腹腔内放入冰块可以使温度短时间从正常体温降到16℃。尽管大多数研究建议最佳的保存温度是4℃，但是对低温保存的肝脏实时测量发现肝脏的核心温度通常在0℃。在运输及其后修肝过程中，保持低温非常重要。
（二）保存液
器官保存液的快速发展解决了低温保存中的很多问题。保存液中的成分可以缓解低温保存对于器官的损伤。良好的器官保存液应具有以下特征：防止低温诱导的细胞肿胀、防止电解质紊乱、防止细胞内酸中毒、减少ROS的产生和为细胞代谢提供能量及底物。
1.Collins液
1969年Collins发明了肾脏低温保存液。这种保存液提供了渗透压平衡，并抑制低温引起的细胞水肿。Collins用磷酸缓冲液防止电解质紊乱。保存液中的高糖为细胞内外提供酵解所需的能量。随后，Collins液被欧洲学者改良成Euro-Collins液。Euro-Collins液葡萄糖含量更高，因此渗透压更大（195mmol/L vs. 140mmol/L）。另外，保存液中没有镁离子，因为镁离子和磷酸盐可以形成磷酸镁沉淀。这两种Colins液都可以低温保存肾脏24～30小时。但随着UW液和HTK液的出现，Euro-Collins液逐渐不再被使用。
2.UW液
UW液使移植物可以进行远距离运输，包括美国与加拿大之间，北美洲与欧洲之间。UW液通过延长冷保存时间，缓解了肝移植手术过程的紧急程度，使其成为半选择性的过程。尽管目前很多的替代保存液不断出现，但UW液仍是目前腹腔器官保存的标准。
和Euro-Collins液相比，UW液可以将肝脏保存超过15小时。棉子糖和乳糖醛酸钠代替了葡萄糖作为非渗透性物质。乳糖醛酸钠含有乳糖醛酸阴离子，是双糖的羧基酸。羟乙基淀粉作为细胞外抗肿胀的物质。阿糖腺苷用来作为再灌注时ATP合成的底物。谷胱甘肽作为氧自由基清除剂，别嘌醇作为黄嘌呤氧化酶的抑制剂。地塞米松作为膜稳定剂。
3.HTK液
HTK液最初作为心脏停搏的保存液。1980年，HTK液开始在临床上作为心脏移植的保存液使用。HTK液含有和细胞内相同浓度的钠离子（15mmol/L）和稍高的钾离子（10mmol/L）。这种离子浓度可以使心脏电活动降低，并使心脏暂停跳动。HTK液使用组氨酸-HCL作为维持pH的缓冲液。甘露醇用来保持渗透压防止细胞肿胀。酮戊二酸盐和组氨酸可以作为细胞能量代谢的底物，而色氨酸是细胞膜保护剂。在人体肝移植通常的冷保存时间内应用HTK液与UW液具有相同的保存效果。
4.Celsior液
Celsior液是相对低钾的心脏保存液，含有UW液和HTK液的成分（乳糖醛酸盐和组胺）。初步研究认为Celsior液可能对肝脏保存有效。和HTK液相同，Celsior液最初也用于心脏移植的低温保存。尽管Celsior液的成分和UW液非常相近，但是Celsior液的离子浓度主要模仿细胞外正常浓度，而非细胞内浓度。和UW液相似，Celsior液通过大分子物质如乳糖和甘露醇维持渗透压，防止细胞肿胀。Celsior液使用组氨酸作为缓冲液防止细胞酸中毒，同时组氨酸和谷氨酸作为细胞能量代谢底物。谷胱甘肽和甘露醇有抗氧化的保护作用。Celsior液的黏稠度小于UW液，因此在器官冲洗时效果更好。Celsior液在1999年也被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于肝移植保存。
（三）静态低温保存应该选择哪种保存液
器官保存的原则是低温下应用上述器官保存液中的一种进行冲洗和保存。尽管Collins液和Marshall液可以将肾脏保存24～36小时，但对于肝脏保存时间较短（4～8小时）。UW液冷保存12小时后肝脏仍可保持功能良好。但UW液黏稠度过高、价格高昂，并且容易出现高钾导致的心搏骤停，再灌注之前需对肝脏进行再次冲洗。HTK液和Celsior液黏稠度低，钾离子低，一次灌注迅速并且不需要再灌注前冲洗肝脏。这些优点使得一些中心开始考虑用HTK液和Celsior液代替UW液。美国HTK液的使用率从2004年的16.8%升高到2008年的26.9%。尽管很多研究比较了HTK液、Celsior液和UW液的功能，但是随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）却非常少。目前只有四项RCT研究比较了HTK液、Celsior液和UW液。其中只有一项质量较高。所有的RCT都提示HTK液、Celsior液和UW液的患者生存率与移植物生存率无差异。一项使用美国器官共享网络注册系统（United Network for Organ Sharing Registry，UNOS）数据库分析UW液（n=12 613）和HTK液（n=4 755）的研究发现，HTK液的移植物失功比例高，特别是在心脏死亡患者中。目前UW液仍然是肝脏保存的金标准。
即使肝脏保存液的冷保存效果显著提高，原发性移植肝无功能的发生率仍为5%～20%。随着供者标准的放宽、边缘供者的应用，其发生率可能会更高。出现原发性移植物无功能的一大原因可归于冷保存不充分，包括采用保存液不当。因此，仍迫切地需要新的策略来改善器官冷保存。机械灌注的出现就是以延长保存时间、提高保存效果为目的，从而最终达到提高肝移植效果的目的。
三、肝脏保存的新策略
（一）肝脏缺血的预处理
缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）是最有效和简便易行的缺血损伤的保护技术之一。缺血预适应指在短暂缺血后再灌注，对随后进行长期缺血操作起到保护作用。这种现象首先在肾脏和心脏保存中发现。肝脏热缺血模型研究发现在5～10分钟的缺血过程后进行10～15分钟的再灌注，然后长期缺血，可以减少肝脏的损伤，提高生存率。预处理有效避免了正常温度下缺血肝脏的再灌注损伤，将影响实验动物存活的器官损伤转变为非致命性损伤。临床IPC首先由Clavien在进行阻断肝切时发现。随后，IPC在冷缺血中的作用被研究。
IPC的分子机制非常复杂，包括氧化应激和酪氨酸激酶相关机制。其他的机制包括NO和腺苷的作用等。其保护机制包括下调半胱氨酸天冬酶途径来阻止HSEC和肝细胞凋亡，同时对再灌注前的冷保存阶段肝脏起到保护作用。预处理抑制了内皮细胞变形、分离和MMP的活性。缺血预处理几乎完全阻断了冷保存肝脏再灌注时发生的HSEC凋亡，这种保护作用可能是由短暂的亚致死剂量的氧自由基暴发所致。实际上，缺血预处理过程中发生的适度氧化性应激对随后发生的致死性损伤具有天然保护作用，温缺血模式下也具有同样现象。
（二）药物处理
移植肝脏可在手术前后进行药物处理。开放前的处理为预处理，再灌注期间的处理为后处理。尽管在动物实验模型中很多药物表现出了保护作用，但是只有很小的一部分进行了药物临床试验。一项早期的临床试验发现给供者在夹闭前系统性注射前列环素可以通过改善肝窦灌注减少IRI。持续为供者进行甲泼尼龙输注可以减少肝脏损伤，降低急性排斥发生率。供者无肝期和术后注射抗胸腺细胞球蛋白可以减轻IRI并改善移植物功能。其原理可能与抑制再灌注后的免疫反应有关。一项随机试验发现术中吸入NO可以提高移植物功能。
（三）机械灌注
随着扩大标准的供者（expanded criteria donor，ECD，又称边缘供者）和DCD器官使用的增加，移植物早期功能障碍和长期并发症有所增加，且随着长期冷藏进一步加重。机械灌注（machine perfusion，MP）是由Belzer在19世纪60年代初提出的，近十年来成为受欢迎的器官保存方法。一般来说，MP系统由泵、容器、收集器、生理记录器/监测仪（计算机）、热交换器、氧合器和连接线组成。MP系统分为低温、亚低温和常温，温度分别维持在0～12℃、25～34℃和35～38℃。MP作为一种替代的保存策略，有可能通过延长肝脏的保存时间、改善ECD肝功能来监测正常灌注时的动态活力和损伤肝脏的功能修复。目前低温有氧灌注（hypothermic oxygenated perfusion，HOP）和常温有氧灌注（normothermic oxygenated perfusion，NOP）在猪模型中进行了详细的研究，并且部分临床试验也在开展。
体外机械灌注系统可以阻断生物降解、良好保存组织。它通过持续为供者提供必需的底物（如葡萄糖、氨基酸、核苷、氧）并处理毒性代谢产物，良好保存了移植器官活力。氧作为原料维持着所有细胞活性，使得细胞产生充足的ATP，后者是细胞能量的流通形式。冷保存期血液停止流动，氧及营养物质的供应随之减少。将ATP消耗减少至最低程度对控制缺血损伤极为重要。减少ATP消耗需要以氧化性溶液灌注肝脏。将鼠肝灌注保存可以完全抑制冷保存期间ATP的消耗，甚至可维持长达48小时。另一项研究在冷缺血后对小鼠肝脏进行45分钟的复温，发现随着冷缺血时间的延长，肝酶逐渐升高、ATP减少。复温前以不含血液的氧化性溶液灌注肝脏30分钟可以保护肝脏功能、降低ATP消耗，甚至可达到未经过冷保存的对照组水平。
器官持续灌注的理想灌注液尚未确定，应该包含携氧载体，能将氧输送至器官以获得最佳灌注效果。单纯的氧化性缓冲液需要较高的流动性以利组织充分获氧、降低变性，而以红细胞为氧载体则无须上述要求。高流动性灌注液不仅加重了组织损伤，还降低了肝脏首过消除效应。一般认为红细胞比容为20%为达到了血流动力学指标和携氧能力的最佳结合点。除氧载体外，灌注液还加入了自由基清道夫、炎性介质、胰岛素、钙通道阻滞剂、胆盐和营养物质，以持续供给细胞。此外还有多种技术应用于机械灌注，如模仿腹腔内条件的压力振动，再循环的灌注液同时进行透析以清除水溶性毒素、调节pH和电解质，进行常温灌注而非低温灌注。
目前，持续灌注仅在少数几个中心用于肾脏保存。机械灌注系统的复杂性和昂贵价格仍限制了其临床应用。
低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）通过连续4～6℃的灌注，既持续保持器官的低有氧代谢环境，还可以去除肝脏内部废物，灌洗肝内淤血、血栓以及提供代谢底物，以延长保存及改善供肝内环境。商业冷灌注设备及动物实验采用3～5mmHg（1mmHg=0.133kPa）的门静脉压、20～30mmHg肝动脉压。
亚低温机械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）的灌注温度为20～30℃，灌注液为肝提供代谢营养成分及氧气，通过灌注液的血气、生化参数评价肝活性，促进离体肝细胞合成ATP，促进肝生理功能的恢复。SNMP系统主要由动力单元、循环单元、器官单元、温控单元、氧合单元组成。通常常温机械灌注设备都可以直接用于SNMP，肝动脉灌注控制在60mmHg，门静脉压控制在2～6mmHg。
常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）最大的特点就是灌注温度与人体温度一致。模拟生理环境，维持系统环境温度在32～37℃，主要通过灌注液持续补充营养物质，修复热缺血过程的损伤，以恢复供器官能量储备，维持器官的正常代谢。NMP主要涉及的系统参数包括温度、压力、流量等。温度根据肝脏所处的人体生理温度而定，压力参数有门静脉压力和肝动脉压力，利用离心泵管路系统，分别模拟产生与人体生理值相符的压力，门静脉灌注压力为4～8mmHg，肝动脉灌注压力在60～80mmHg。
常温有氧灌注（NOP）的优势是模拟器官正常的生理环境。使用血液作为灌注液，可通过肝脏的氧气消耗量、胆汁生成量和尿素合成量实时监测肝脏功能。这项技术可以获得更长的保存时间。一项使用猪肝进行NOP的研究发现，NOP可以在体外维持肝脏活性到72小时。另一项实验中，NOP使得缺血60分钟的猪肝脏恢复功能，而未进行NOP的肝脏出现移植物无功能。研究显示NOP可以改善脂肪肝的脂肪变和代谢能力。
器官获取前供器官体内常温局部灌注（normothermic regional perfusion，NRP）因其可以改善DCD供肝质量、提升供肝利用率和移植成功率，保障受者的安全，近年来成为研究热点。NRP技术类似体外膜氧合。宣布患者死亡后，利用供者自身血液对供器官进行灌注，即通过供者股动脉和股静脉分别插入导管，外接离心泵和氧合器，常温下将经过氧合的血液通过动脉导管灌注入体内，以恢复并改善供器官（主要是腹部器官）微循环灌注和氧合，达到减少热缺血损伤、改善供器官功能的目的。NRP不同于体外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO），为了保证供器官局部灌注血流量，避免不必要的脑血流灌注，灌注过程中通过预置的动脉球囊导管阻断胸主动脉，使氧合血液灌注局限于腹部器官。NRP在欧美国家已广泛用于DCD供肝维护。利用NRP对不可控性DCD进行维护已经成为欧美国家的金标准和主要手段。
NOP的替代方法是HMP，氧气供应可选。HOP的原理是降低线粒体呼吸和活性氧化产物的生成。与NOP相比，HMP的灌注压力和流速更低，并且使用改良的Collins液。HMP在长期（24～72小时）、中期（3～7小时）和短期（1～2小时）保存器官的疗效在很多实验中都得到了证实。临床试验中20名患者接受了经过3～7小时HOP，与对照组相比，HOP患者的移植物失功率低（5% vs 25%），住院天数短（10.9日vs 15.3日）。HMP保存的肝脏炎症因子和ICAM-1含量均降低。研究发现HOP的肝脏更耐受IRI和心脏死亡相关损伤。
（四）深低温保存
目前深低温保存是肝细胞长期保存的主要方法，影响其冻存效果的因素有很多，如冻存保护剂的选择、冻存剂的浓度、细胞的浓度、降温和复温方法等。其主要应用于肝组织的细胞学保存方案，对于移植的整器官保存暂时缺少确定性的相关研究。
（蔡金贞）