第二节　结核感染检测

目前，LTBI 诊断尚缺乏“金标准”，主要是通过检测机体的结核病特异性免疫反应表明机体是否受到结核分枝杆菌感染。常用的检测方法包括：皮肤试验［（结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）、重组结核杆菌融合蛋白（EC）皮肤试验以及γ干扰素释放试验（interferon-γ release assay，IGRA）。

一、结核菌素皮肤试验

TST的特点是操作简单、不需要特殊设备和实验室操作，是临床上广泛使用的LTBI筛查和病原学阴性肺结核辅助诊断的免疫学方法。

（一）原理

TST是基于Ⅳ型迟发型变态反应的一种皮肤试验。将结核分枝杆菌抗原注射于人体皮肤内，会激发机体产生细胞免疫反应，激活T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞增殖、聚集，包裹抗原形成结节，其反应强度与细胞免疫呈正相关。

（二）检测试剂

纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）是通过结核分枝杆菌或卡介苗菌经培养、杀菌、过滤去除菌体后纯化制成，是最为常用的TST制剂。目前在我国注册上市PPD 产品有结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）及卡介菌素（BCG-PPD）。

1.操作方法和查验反应

（1）操作方法：

在左前臂掌侧前1/3中央皮内注射0.1mL，以局部出现直径7～8mm的圆形橘皮样皮丘为宜。

（2）查验反应：

72小时（48～96小时）检查反应，以局部皮下硬结平均直径为准。

2.判定标准

（1）在没有卡介苗接种和非结核分枝杆菌干扰时，PPD 反应硬结直径不小于5mm 应视为已受MTB感染。

（2）在卡介苗接种地区和/或非结核分枝杆菌有感染地区以 PPD 反应硬结直径不小于10mm 为结核感染标准。

（3）在卡介苗接种地区和/或非结核分枝杆菌流行地区，对 HIV 阳性、接受免疫抑制剂时间超过1个月和与涂阳肺结核有密切接触的未接种卡介苗的5岁以下儿童PPD反应硬结直径不小于5mm应视为感染。

（三）优缺点

基于PPD的TST已经在世界范围内安全应用近百年，并且由于其成本低、操作简单，不需要借助特殊仪器，因此适合于在各级医疗卫生机构使用，目前仍然是检测LTBI的重要手段之一。

结核菌素含有200多种抗原，这些抗原为致病性分枝杆菌、非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）和卡介苗（BCG）所共有，使用PPD检测不能明确区分，试验结果可能出现假阳性。由于TST反应机理是基于Ⅳ型迟发型变态反应，因此在HIV 感染患者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下的人群中容易出现假阴性。TST检测还存在费时（48～72小时）、需要受试者回访、检测结果的测量和解释存在主观依赖性等缺点。

二、重组结核杆菌融合蛋白（EC）皮肤试验

我国自主研发的重组结核杆菌融合蛋白（EC）是由高效表达MTB的ESAT6和CFP10的大肠埃希菌经发酵、分离和纯化后制成。ESAT6和CFP10均是结核分枝杆菌早期分泌的低分子量蛋白，在结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌基因组（除堪萨斯分枝杆菌、苏加分枝杆菌、海分枝杆菌和微黄分枝杆菌外）中有表达，而在所有卡介苗菌株和大多数环境分枝杆菌中不表达，能够诱导结核特异的皮肤迟发型变态反应，卡介苗接种者和大多数非结核分枝杆菌感染者不产生假阳性。

1.适用对象

用于6月龄及以上婴儿、儿童及65周岁以下成人，结核潜伏感染的诊断和病原性阴性肺结核的临床辅助诊断。因试验结果不受卡介苗（BCG）接种和非结核分枝杆菌感染的影响，对儿童结核病诊断和NTM高流行区人群检查具有更好的诊断价值。

2.产品规格

在我国上市使用的重组结核杆菌融合蛋白（EC）制剂产品规格有4种：每瓶0.1mL、0.3mL、0.5mL和1.0mL。

3.试验方法

在左前臂掌侧前1/3中央皮内注射，注射剂量为每人皮内注射0.1mL（5IU）。

4.结果测量

注射后48～72h检查注射部位反应，测量记录红晕和硬结的横径及纵径的毫米数，以红晕或硬结平均直径大者为判断标准，即如果红晕平均直径大于硬结平均直径，则以红晕平均直径作为判断标准，反之，如果硬结平均直径大于红晕平均直径，则以硬结平均直径作为判断标准。

5.阳性结果

判断反应平均直径（横径与纵径之和除以2）不低于5mm为阳性反应，即在实际应用判断中，反应平均直径（横径与纵径之和除以2）≥5mm为阳性反应，不论反应平均直径大小，凡有水疱、坏死、淋巴管炎者均属强阳性反应。

三、γ干扰素释放试验

IGRA具有高敏感性和特异性，主要用于临床检测，诊断结核感染，辅助菌阴结核病、肺外结核病和儿童结核病的诊断和鉴别诊断。

（一）原理

IGRA是采用MTB蛋白质的多肽抗原（包括ESAT6、CFP10和TB7.7），刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素（IFN-γ），检测并定量分析IFN-γ的浓度，判断是否存在MTB特异性细胞免疫反应。IFN-γ为Th1细胞分泌的一种细胞因子，当机体内被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此可用于LTBI的筛查。

（二）检测技术

目前，最常用的γ干扰素释放试验检测方法有两种。

1.酶联免疫吸附试验

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测全血中致敏T细胞再次受到MTB特异性抗原刺激后释放IFN-γ水平，称之为全血检测或结核感染T细胞免疫检测。

2.酶联免疫斑点技术

采用酶联免疫斑点技术（ELISPOT），测定在MTB特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放IFN-γ的效应T细胞数量，称之为细胞检测或结核感染T细胞检测。

（三）判断标准

γ干扰素释放试验检测阳性说明存在结核分枝杆菌感染，临床上可用于 LTBI 的诊断。

（四）优缺点

IGRA采用的抗原与BCG及绝大多数NTM无交叉，可避免BCG接种和NTM感染带来的假阳性。此外IGRA检测所需时间短（一般24～48小时内即可出结果）；不需要受检者回访；在结果判断上的主观依赖性较小，但检测费用高，需要借助仪器设备，人群结核潜伏感染者筛查受到一定的条件限制。